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紫膜

紫膜 purple membrane 为盐生盐杆菌(Halobacterium halobium)和红皮盐杆菌(H.cutirubrum)等嗜盐性细菌在厌氧条件下和明亮处生长时于细胞膜上形成的斑状紫色膜。

用低渗溶液处理菌体,则可以使此膜游离出来,通过密度梯度离心法分级,可以得到板状的膜片段。H.halobium的紫膜成分的75%为细菌视紫红质的色素蛋白,其余的25%为脂质。细菌视紫红质在紫膜中形成三聚体,在0.7nm分辨力下,可以得到此三聚体在膜平面内以六方形晶格状排列的三维结构图像。

紫膜在嗜盐菌原生质膜上以碎片形式存在,直径大约为0.5微米,厚度5纳米(相当于10的负9次方米),它与原生质膜上其余部分红膜共面。碎片中的唯一蛋白质细菌视紫红质以三体形式二维六角形晶格排列在天然紫膜中,蛋白占紫膜干重的75%,其余25%为类脂。晶格尺寸为14纳米,两个蛋白质中心距离约1.5纳米,每个碎片有10万个细菌视紫红质分子。

每个细菌视紫红质分子由248个氨基酸残基的肽链组成,其分子量为26000。该肽链在空间卷曲折叠形成7条跨膜螺旋柱, N端在细胞膜外侧, C端在细胞膜内侧,螺旋柱基本垂直于细胞膜。每个细菌视紫红质结合一个生色团视黄醛,位于216位的赖氨酸上,处于靠近肽链 C端细胞膜内侧。

这种晶格结构排列在生物膜中很独特,增加了膜结构的稳定性,也有利于进行结构分析,使其成为目前生物膜结构研究中最为清楚的膜蛋白之一。1975年Henderson首次解析得到了分辨率为0.7纳米的细菌视紫红质的晶格结构。虽然分辨率不太高,但当时已经是膜蛋白的结构研究的开创性工作,并奠定了细菌视紫红质结构研究的基础。

伴随着电子晶体学的发展,低温电子显微镜以及 X射线晶体衍射技术在细菌视紫红质结构研究中的应用,目前已在0.155纳米的分辨率水平上揭示了细菌视紫红质的表面信息,质子通道内部和分子表面电荷数量和分布情况,内部水分子的位置以及光异构化过程中的变化。

所谓光循环就是光驱动的一系列中间产物的产生,最终又回到初始状态的原始细菌视紫红质。紫膜的功能单元是细菌视紫红质,细菌视紫红质具有暗适应性和光适应性两种,它们之间可以相互转化。暗适应性的生色团是全反型和13-顺式的混合物,而光适应性的生色团是全反型。只有全反型生色团的细菌视紫红质才能进行光循环。已经发现的细菌视紫红质的最初光中间产物称为 I,形成的时间过程为430飞秒,即4.3×10-13秒。之后伴随一系列热驰豫中间态 J, K, L, M1, M2, N和 O再回到光适应的细菌视紫红质( B R)态。

在光化学过程中值得注意的是其中两个较为稳定的中间产物 K和 M,尤其是 M产物引起了很多研究者的兴趣。首先质子在 M态形成前释放出来,又在 M态衰减后再摄取进去。 M态与质子泵的功能密切相关,另外, M态的吸收峰波长在410纳米与基态570纳米相距很远,光谱之间不产生重叠,这为光子器件应用提供了充分的条件。在光化学循环过程中发生了生色团视黄醛的异构化,即从全反型式变成13-顺式,这与暗适应时的13-顺式有差别,再从13-顺式回到全反型式。同时还产生去质子化和重质子化的过程,在基质时希夫碱基是质子化的,到 M态时希夫碱基是去质子化的,再回到质子化的其它中间态和基态。

细菌视紫红质的光化学循环的途径并不是唯一的,处于不同的条件下的细菌视紫红质分子会有不同的循环途径。在低 p H下和高 pH下循环途径不一样,在某种条件下可产生一些不同的中间产物,如 P态和 Q态中间体,它们的吸收峰波长分别是490纳米和380纳米,其生色团视黄醛为9-顺式,此产物是十分稳定的中间态,光谱与基态差别更大,因此更具有实际的应用前景,但由于 Q态的产率很低,目前还有待进一步研究和改进。

对于光循环的途径,目前提出了不同的模型,如单向的线性模型、协同模型、平行模型和分支(旁路)模型。这些模型都有一些实验根据,但又很难解释一些现象,很可能不同的模型表示了不同的条件下光循环过程。由于光循环的一些中间体在相近的时间域内出现,各中间体的吸收光谱范围又互相覆盖重叠,从而使研究这些中间体之间的相互变化规律变得很困难,因此到目前为止对光循环还不能得到很满意的解释。

光照射嗜盐菌时有三种作用:即 A TP增加、基质酸化(基质酸化表示质子从细胞内泵到了细胞外)和呼吸被抑制。如果用 p H电极测量紫膜悬浮液时,很容易观测到光驱动的质子释放,即光驱动质子泵功能。质子是如何从膜内泵到膜外的?因为膜本身是个屏障,不允许质子自由地进入或释放。质子泵是定向地转运质子,其中必定有质子的受体和质子的供体。目前的研究表明,天冬氨酸85(Asp85)是质子的受体,而天冬氨酸96(Asp96)是质子的供体,即细菌视紫红质希夫碱基上的质子转移给天冬氨酸85,再从天冬氨酸96上得到质子,那么是如何转运出去的呢?细胞膜上一定有一个质子的通道,使质子能从细胞内转运到胞外。

虽然有关质子泵的机理问题还有待于进一步探讨,但质子转运的主要步骤已经清楚,主要步骤如下:

①光激发使细菌视紫红质生色团异构化,由全反视黄醛变成13-顺式视黄醛,希夫碱基的位置变化影响到某些邻近的氨基酸残基导致蛋白质构象变化;

②希夫碱基将一个质子传给去质子化状态的 Asp85,希夫碱基成去质子化状态;

③质子通过某一未知基团释放到胞外,此质子不是直接来自于希夫碱基的质子;

④质子化的 Asp96把质子传递给去质子化的希夫碱基,希夫碱基重质子化;

⑤去质子化的 Asp96从胞内侧又重新获得质子;⑥蛋白质构象变化,生色团由13-顺式异构化为全反形式细菌视紫红质回复到基态。

膜上质子转运与光循环的相互关系十分复杂,但某些关系可以确定,如 L→ M的转换,相应于希夫碱基的质子转运给 Asp85的过程; M→ N的转换,相应于去质子化的希夫碱基从 Asp96得到质子的过程; N→ O转换相应于 Asp96从介质中得到质子。

在质子泵功能研究中发现了值得注意的几个问题:

①在细菌视紫红质分子中结合着几个镁离子,如果把这几个离子去掉,则紫膜变成蓝膜,蓝膜没有质子泵功能,也不进行光循环。这几个离子的神奇作用是什么?用其它金属离子代替镁离子就能恢复其功能,并变回紫色膜。

②在质子转运过程中,质子要跨越氨基酸残基之间的距离,在细菌视紫红质分子内部的水分子是不可缺少的组成部分,现已证实在质子通道中至少有8个水分子,这些水分子认为像救火时排成一排的水桶一样,它们帮助蛋白质的氨基酸进行质子转运。

③单体细菌视紫红质分子也有质子泵和光循环的功能,那么为什么天然状态要以三聚体存在?

光照紫膜时,伴随质子泵功能的同时,电信号也可以产生。这一现象产生的原因归纳为质子流本身为带正电的电荷移动。所以当细菌视紫红质引入到人工膜上并施以稳定的连续光照射时,将产生跨膜质子流。由于双层膜有较好绝缘性,质子梯度不会很快通过浓度扩散而消失,于是在膜两侧产生了电势,即光电压;同时在电流计上可以测量到光电流信号。这种稳态的或慢的光电响应信号来源于质子流。

若用一个瞬间光脉冲照射紫膜时,电极可以引出一个快速瞬时的光电响应信号,对于间断光照射时,可以引出对光强度变化对应的微分响应特性的光电响应信号。快速瞬时的光电响应信号为纳秒量级或更快速的过程,在3皮秒光脉冲激发下测得上升时间小于5皮秒的光电压,这是生物样品观察到的最快的光电响应信号。质子跨膜流不可能达到如此快速的反应,这种光响应认为是细菌视紫红质分子内部生色团快速光极化引起的电荷分离和希夫碱及其周围氨基酸去质子化和重质子化过程引起的质子在膜内移动产生的位移电流。而微分响应是由于光驱动在光开和关瞬间引起的与紫膜光电池系统光放电以及测量电路的耦合特性所引起的。

对于光电响应本身的解释一直存在争论,不少模型电路的提出,企图解释其产生的机理。尤其在光电响应与质子泵和光循环中间体的相互关系方面,还缺少令人信服的实验结果。尽管如此,光电响应信号的应用研究则可以不受机理的约束,受到大家极大的关注。

紫膜的结构和功能的特点,决定了紫膜材料可作为优良的纳米生物材料之一。它结构上的稳定性是一般的生物材料不可能达到的。也许由于二维六角型晶格结构的缘故,在器件所要求的干膜状态下,紫膜可以在-30℃到140℃的状态下不失去活性,此时一般的蛋白质早已变性。

紫膜作为纳米生物材料可用于构造生物分子器件的内在原因在于:第一,光驱动质子泵的功能可实现太阳能转换成化学能和电能;第二,光照产生的分子内的电荷分离产生的光电特性可制成光电子器件;第三,细菌视紫红质光循环中间体之间产生的光致变色特性可用于光子器件。细菌视紫红质有几个高的特性,即:高空间分辨率,大于5000线/毫米;高光灵敏度10-3焦耳/平方厘米;高的循环次数,大于106次循环;和高速光反应,430飞秒。这些高特性有望制作出优良性能的纳米生物器件。

除稳定性和高特性之外,细菌视紫红质还有以下几个特性有利于制作纳米生物器件:

1.取材容易,可以大量繁殖和培养以及分离得到紫膜样品,因此成本相对低廉,具有商业价值。

2.天然的微生物材料,培养提取以及制作时对自然界和人类不会造成损害和环境污染,是一种纯“绿色”生物功能材料。

3.除温度稳定性外,在失水状态、 p H很宽的范围里也保持活性。

4.细菌视紫红质可以通过基因工程技术、生物和化学改性等方法改变特性以利于更好的应用。

5.可以通过不同的组装技术,如分子识别组装、电沉积、 L B膜技术、 B LM组装成不同分子排列形式和结晶的分子膜系统,以便于符合于不同的器件要求。

6.可以与高分子聚合物进行特殊工艺的混合,从而在光学均匀性、分子排列结构和物理强度等方面得到改善和加强。

7.有良好的双光子吸收性能和良好的非线性光学特性。

8.细菌视紫红质有较大的吸收面积,可以利用很弱的光能,在光循环过程中吸收波长发生很大变化,存在多个明显区分的中间态,有利于双稳态器件的制作。

9.正反向都有较强的量子产率并与波长无关。

在纳米生物器件可能的应用前景方面,最为突出的是细菌视紫红质的光致变色性能、瞬态光电响应性能和非线性光学性能。

在光致变色性能方面有望用于:光学信息处理和光储存;生物芯片和生物计算机;全息照相和存储;边缘增强器;光模式识别;三维光记忆;傅立叶变换和处理;神经网络;光相关转换和相关器;光逻辑门和二进制光记忆;光寻址直接显示器。

在瞬态光电响应方面有望用于:光开关和光电探测器;太阳能电池;超快光二极管;仿视觉功能人工视网膜、人工感受野;图像传感器、运动探测和像边检测。

在非线性光学方面有望用于:光过滤包括新事物滤波、振幅滤波、光学图像单调滤波;相位共扼;光压器件;二次谐波发生器;空间光调制器;光晶体管和离子敏感的场效应晶体管。

总之,目前世界上有大批研究人员从事于紫膜的研究工作,并有大工业集团参与和资助研究,在细菌视紫红质作为纳米生物材料研制混合型的生物芯片计算机、海量三维光存储器已投入相当大的人力和财力,一旦有所突破,将会带来革命性的变化。紫膜的研究,需要生物学、化学、物理学、计算机科学、半导体和电子学等多学科的交叉和融合,才能结出丰硕的成果,让我们等待这一天的到来吧!

紫膜的国际价格在每克10万美元左右,相当于黄金价格的1万倍。


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