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荧光共振能量转移技术

荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠,并且两个分子的距离在10nm范围以内时,就会发生一种非放射性的能量转移,即FRET现象,使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭),而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。

荧光能量共振转移是距离很近的两个荧光分子间产生的

一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠,并且两个分子的距离在10nm范围以内时,就会发生一种非放射性的能量转移,即FRET现象,使得供体的荧光强度比它单独存在时要低的多(荧光猝灭),而受体发射的荧光却大大增强(敏化荧光)。

在生命科学领域,FRET技术是检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具,可用于检测某一细胞中两个蛋白质分子是否存在直接的相互作用。正如前述,当供体发射的荧光与受体发色团分子的吸收光谱重叠,并且两个探针的距离在10nm范围以内时,就会产生FRET现象。而在生物体内,如果两个蛋白质分子的距离在10nm之内,一般认为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。

FRET技术得以在生物体内广泛应用,与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的应用和改造是密不可分的。

GFP由11个β片层组成桶状构成疏水中心,由α螺旋包含着的发光基团位于其中。这个发光基团(chromophore)是由3个氨基酸(Ser65、Tyr66、Gly67)经过环化、氧化后形成的咪唑环,在钙离子激发下产生绿色荧光。野生型GFP吸收紫外光和蓝光,发射绿光。通过更换GFP生色团氨基酸、插入内含子、改变碱基组成等基因工程操作,实现对GFP的改造,如增强其荧光强度和热稳定性、促进生色团的折叠、改善荧光特性等。

GFP近年来发展出了多种突变体,通过引入各种点突变使发光基团的激发光谱发射光谱均发生变化而发出不同颜色的荧光,有BFP,YFP,CFP等。这些突变体使GFP应用于FRET成为可能,为FRET技术用于活体检测蛋白质相互作用提供了良好的支持。

青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein, CFP)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)为目前蛋白-蛋白相互作用研究中最广泛应用的FRET对。CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱相重叠。将供体蛋白CFG和受体蛋白YFG分别与两种目的蛋白融合表达。当两个融合蛋白之间的距离在5-10nm的范围内,则供体CFP发出的荧光可被YFP吸收,并激发YFP发出黄色荧光,此时通过测量CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白是否相互作用。两个蛋白距离越近,CFP所发出的荧光被YFP接收的量就越多,检测器所接收到的荧光就越少。

如Tsien & Miyawaki采用FRET技术检测细胞内Ca2+的浓度变化。他们将CFP和YFP分别于钙调蛋白和钙调蛋白结合肽融合表达于同一个细胞内。当细胞内具有高的Ca2+浓度时,钙调蛋白和钙调蛋白结合肽结合,可诱发FRET,使受体蛋白YFP发出黄色荧光,因此细胞呈黄色。当细胞内Ca2+浓度低时,FRET几乎不发生,因此检测时CFP被激发,发出绿色荧光,细胞呈绿色。

阳离子共轭聚合物为基础的荧光共振能量转移(cationicconjugatedpolymer-basedfluorescenceresonanceenergytransfer,生物通译),共轭聚合物具有较强的光捕获能力,可用来放大荧光传感信号,提高检测的灵敏度。以共轭聚合物作为生物传感元件,在生物大分子(如核酸、蛋白质)高灵敏检测以及医疗诊断等方面的研究越来越受到人们的关注。

近年来阳离子共轭聚合物荧光探针以及荧光共振能量转移技术在DNA单核苷酸多态性(SNP)、DNA甲基化以及DNA损伤检测与传感等方面发挥了越来越重要的作用,由于这种新检测技术具有较高的灵敏度和特异性,引物无需染料标记,检测在均相溶液中进行,无需分离、纯化步骤,因此在重大疾病早期高灵敏诊断、药物设计以及个体化用药等方面具有重要应用前景。

(基于阳离子共轭聚合物的DNA甲基化以及SNP检测原理)

研究人员利用这种新技术,通过逐步辨别分析,以及对甲基化变化的累计检测,获得了高精确度和灵敏度的结肠癌检测(精确度为86.3%,灵敏度为86.7%),以及鉴别诊断结果(分别为97.5%和94%)。

而且研究人员还发现了CpG岛甲基化表型,与结肠癌患者临床上重要参数之间的一种关联。这种通过阳离子共轭聚合物为基础的荧光共振能量转移方法,积累分析启动子甲基化变化的技术,将能用于结肠癌患者的筛查和鉴别诊断,并进行临床相关性分析

最近,基于探针SR成像技术的光敏定位显微镜(PALM)和随机光学重建显微镜(STORM),以及借助荧光基团随机激活特性的荧光光敏定位显微镜(FPALM)都已经取得了成功。

  通过基于探针的SR成像技术,可以获得多张原始图像。在每一张原始图像中,细胞内只有一部分被荧光标记的分子能发出荧光,即这些荧光分子都处于不断激活和灭活的交替状态,每一次都只有部分分子能被观察并成像。而且由于每次发出荧光的分子都分散得较为稀疏,因此相互之间不会受到影响,也就避免了因相邻分子发出荧光而无法分辨的问题。最后将这些原始图片叠加、重合在一起就得到了最终的高分辨率图像。这样,就能使得那些以前由于荧光点太密以至于无法成像的结构的分辨率达到纳米级水平,而且成像的分子密度也相当高,可以达到105个分子/μm2。


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