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培养基

培养基(Medium)是供微生物、植物组织和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)以及维生素和水等。不同培养基可根据实际需要,添加一些自身无法合成的化合物,即生长因子。有些微生物,如自养型微生物,不需要碳源,所以上述物质只具有一般性。

培养基(Medium)是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料,一般都含有水、氮源、无机盐(包括微量元素)、碳源、生长因子(维生素、氨基酸、碱基、抗菌素、色素、激素和血清等)等。

培养基由于配制的原料不同,使用要求不同,而贮存保管方面也稍有不同。一般培养基在受热、吸潮后,易被细菌污染或分解变质,因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基(如组织培养基),较长时间的贮存,必须放在3-6℃的冰箱内。由于液体培养基不易长期保管,均改制成粉末。

1.配料

配方换算→在容器中加入少量水(蒸馏水,自然水)→按照配方称取各种药品(依次加入)→加足所需水量(一药一勺,取药后立即盖上瓶盖)。

2.溶解

淀粉溶解:少量冷水调成糊状

加热溶解,特别是加有琼脂的培养基,一定要煮沸,琼脂的熔解温度95-97℃ ,且需要边加热边搅拌以防止烧焦。

3.调PH

用1N的盐酸或1N的 NaOH把培养基调节到所要求的值。

4.过滤

滤纸或棉花进行过滤。(有时可以省去)

5.分装

一般培养基放在三角瓶或试管中灭菌使用。

(1)三角瓶

若作静置培养,则100ml培养基/250ml的三角瓶,最多不能超过150ml培养基/250ml的

三角瓶,否则灭菌时培养基沸腾容易污染棉塞,造成染菌;若作摇瓶培养,则15-20ml培养基/250ml的三角瓶,保证通气良好。

(2)试管分装

液体培养基一般装4-5ml,约试管的1/4高度;

固体斜面培养基一般装3-4ml,约试管的1/5高度。

6.包扎

分装好后,塞上棉塞,在用牛皮纸将棉塞包裹好,防止灭菌时水份进入把棉塞弄湿。

7.灭菌

按配方上要求的温度、压力进行高压蒸汽灭菌。如果灭菌的温度太高,营养成分会被破坏,培养

基中的糖、氨基酸会使培养基的颜色变深。

8.摆斜面

灭菌后需要摆斜面的试管要趁热斜着摆放,使其凝固成为一个斜面,约占试管长度的1/2。

9.贮存

培养基在30℃下放置一天,无污染的即可使用。一般用牛皮纸包裹好存放于2-8℃冰箱中备用

1、选择适宜的营养物质
  总体而言,所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源,但由于微生物营养类型复杂,不同微生物对营养物质的需求是不一样的,因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。自养型微生物能从简单的无机物合成自身需要的糖类、脂类、蛋白质、核酸、维生素等复杂的有机物,因此培养自养型微生物的培养基完全可以(或应该)由简单的无机物组成。例如,培养化能自养型的氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxdans)的培养基组成见表3.9。在该培养基配制过程中并未专门加入其他碳源物质,而是依靠空气中和溶于水中的CO2为氧化硫硫杆菌提供碳源。
  就微生物主要类型而言,有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、原生动物、藻类及病毒之分,培养它们所需的培养基各不相同。在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基(或简称普通肉汤培养基)培养细菌,用高氏I号合成培养基培养放线菌,培养酵母菌一般用麦芽汁培养基,培养霉菌则一般用查氏合成培养基。
  2、营养物质浓度及配比合适
  培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好,营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需,浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用,例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长,反而起到抑菌或杀菌作用。另外,培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累,其中碳氮比(C/N)的影响较大。严格地讲,碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值,有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比。例如,在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中,培养基碳氮比为4/1时,菌体大量繁殖,谷氨酸积累少;当培养基碳氮比为3/1时,菌体繁殖受到抑制,谷氨酸产量则大量增加。再如,在抗生素发酵生产过程中,可以通过控制培养基中速效氮(或碳)源与迟效氮(或碳)源之间的比例来控制菌体生长与抗生素的合成协调。
  3、控制pH条件
  培养基的pH必须控制在一定的范围内,以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同,一般来讲,细菌与放线菌适于在pH7-7.5范围内生长,酵母菌和霉菌通常在pH4.5-6范围内生长。值得注意的是,在微生物生长繁殖和代谢过程中,由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累,会导致培养基pH发生变化,若不对培养基pH条件进行控制,往往导致微生物生长速度下降或(和)代谢产物产量下降。因此,为了维持培养基pH的相对恒定,通常在培养基中加入pH缓冲剂,常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐(如KH2PO4 和K2HPO4)组成的混合物。K2HPO4溶液呈碱性,KH2PO4溶液呈酸性,两种物质的等量混合溶液的pH为6.8。当培养基中酸性物质积累导致H+浓度增加时,H+与弱碱性盐结合形成弱酸性化合物,培养基pH不会过度降低;如果培养基中OH-浓度增加,OH-则与弱酸性盐结合形成弱碱性化合物,培养基pH也不会过度升高。
  但KH2PO4 和K2HPO4缓冲系统只能在一定的pH范围内(6.4-7.2)起调节作用。有些微生物,如乳酸菌能大量产酸,上述缓冲系统就难以起到缓冲作用,此时可在培养基中添加难溶的碳酸盐(如CaCO3)来进行调节,CaCO3难溶于水,不会使培养基pH过度升高,但它可以不断中和微生物产生的酸,同时释放出CO2,将培养基pH控制在一定范围内。
  在培养基中还存在一些天然的缓冲系统,如氨基酸、肽、蛋白质都属于两性电解质,也可起到缓冲剂的作用。
  4、控制氧化还原电位(redox potential)
  不同类型微生物生长对氧化还原电位(F)的要求不一样,一般好氧性微生物在F值为+0.1V以上时可正常生长,一般以+0.3一+0.4V为宜,厌氧性微生物只能在F值低于+0.1V条件下生长,兼性厌氧微生物在F值为+0.1V以上时进行好氧呼吸,在+0.1V以下时进行发酵。F值与氧分压和pH有关,也受某些微生物代谢产物的影响。在pH相对稳定的条件下,可通过增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压,或加入氧化剂,从而增加F值;在培养基中加入抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等还原性物质可降低F值。
  5、原料来源的选择
  在配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成分,特别是在发酵工业中,培养基用量很大,利用低成本的原料更体现出其经济价值。例如,在微生物单细胞蛋白的工业生产过程中,常常利用糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、豆制品工业废液及黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等都可作为培养基的原料。再如,工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,而在我国农村,已推广利用人畜粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。另外,大量的农副产品或制品,如鼓皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。
  6、灭菌处理
  要获得微生物纯培养,必须避免杂菌污染,因此对所用器材及工作场所进行消毒与灭菌。对培养基而言,更是要进行严格的灭菌。对培养基一般采取高压蒸汽灭菌,一般培养基用1.05kg/cm2,121.3℃条件下维持15-30min可达到灭菌目的。在高压蒸汽灭菌过程中,长时间高温会使某些不耐热物质遭到破坏,如使糖类物质形成氨基糖、焦糖,因此含糖培养基常在0.56kg/ cm2,112.6℃15-30分钟进行灭菌,某些对糖类要求较高的培养基,可先将糖进行过滤除菌或间歇灭菌,再与其他已灭菌的成分混合;长时间高温还会引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子(特别是钙、镁、铁离子)结合形成难溶性复合物而产生沉淀,因此,在配制用于观察和定量测定微生物生长状况的合成培养基时,常需在培养基中加入少量螯合剂,避免培养基中产生沉淀,常用的螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。还可以将含钙、镁、铁等离子的成分与磷酸盐、碳酸盐分别进行灭菌,然后再混合,避免形成沉淀;高压蒸汽灭菌后,培养基pH会发生改变(一般使pH降低),可根据所培养微生物的要求,在培养基灭菌前后加以调整。
  在配制培养基过程中,泡沫的存在对灭菌处理极不利,因为泡沫中的空气形成隔热层,使泡沫中微生物难以被杀死。因而有时需要在培养基中加入消泡沫剂以减少泡沫的产生,或适当提高灭菌温度。

天然培养基是指一类利用动物、植物或微生物体包括其提取物制成的培养基。例如。牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基和LB培养基等。常用的天然有机营养物质包括豆芽汁、玉米粉、土壤浸液、麸皮、牛奶、血清、椰子汁等。天然培养基成本较低,除在实验室经常使用外,也适于用来进行工业上大规模的微生物发酵生产。

合成培养基是根据天然培养基的成分,用化学物质模拟合成、人工设计而配制的培养基。例如。高氏1号培养基和查氏培养基等。合成培养基有一定的配方,配制合成培养基时重复性强,但与天然培养基相比其成本较高,微生物在其中生长速度较慢,一般适于在实验室用来进行有关微生物营养需求、代谢、分类鉴定、生物量测定、菌种选育及遗传分析等方面的研究工作。

指一类主要以化学试剂配制,同时还加有某种或某些天然成分的培养基。例如,马铃薯蔗糖培养基。

80%~90%是水,其中配有可溶性的或不溶性的营养成分的培养基。

一类配制成的固体状态的基质。根据性质又分为固化培养基、非可逆性固化培养基、天然固态培养基、滤膜。

指在液体培养基中加入少量的凝固剂而配制成的半固体状态的培养基。

又称预制干燥培养基,指含有除水分外的一切成分的商品培养基。

选择性培养基:一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基,具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能,广泛用于菌种筛选等领域。

鉴别培养基:一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂,从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。例如,伊红美蓝乳糖培养基(EMB)。

细菌培养基

牛肉膏琼脂培养基

牛肉膏0.3g ,蛋白胨1.0g,氯化钠0.5g,琼脂1.5g,水100ml

在烧杯内加水100ml,放入牛肉膏、蛋白胨和氯化钠,用蜡笔在烧杯外作上记号后,放在火上加热。待烧杯内各组分溶解后,加入琼脂,不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水,用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值到7.2-7.6,分装在各个试管里,加棉花塞,用高压蒸汽灭菌:1.05千克每平方厘米、121摄氏度维持15-30分钟。

牛心培养基

取新鲜牛心(除去脂肪和血管)250克,用刀细细剁成肉末后,加入500毫升蒸馏水和5克蛋白胨。在烧杯上做好记号,煮沸,转用文火炖2小时。过滤,滤出的肉末干燥处理,滤液pH值调到7.5左右。每支试管内加入10毫升肉汤和少量碎末状的干牛心,灭菌,备用。

根瘤菌培养基

葡萄糖10g,磷酸氢二钾0.5g,碳酸钙3g,硫酸镁0.2g,酵母粉0.4琼脂20g,水1000ml,1%结晶紫溶液1ml。

先把琼脂加水煮沸溶解,然后分别加入其他组分,搅拌使溶解后,分装,灭菌,备用。

放线菌培养基

淀粉硝酸盐培养基(高氏一号培养基)

可溶性淀粉2.0g,硝酸钾0.1g,磷酸氢二钾0.05g,氯化钠0.05g,硫酸镁0.05g,硫酸亚铁0.001g,琼脂2g,水100ml。

先把淀粉放在烧杯里,用5ml水调成糊状后,倒入95ml水,搅匀后加入其他药品,使它溶解。在烧杯外做好记号,加热到煮沸时加入琼脂,不停搅拌,待琼脂完全溶解后,补足失水。调整pH值到7.2-7.4,分装后灭菌,备用。

面粉琼脂培养基

面粉60g,琼脂20g,水1000ml

把面粉用水调成糊状,加水到500ml,放在文火上煮30分钟。另取500ml水,放入琼脂,加热煮沸到溶解后,把两液调匀,补充水分,调整pH值到7.4,分装,灭菌,备用。

微藻培养基

BG-11培养基

NaNO3 1.5g,K2HPO4 3H2O0.04g,MgSO47H2O0.075g,CaCl2 2H2O0.036g Citric Acid (柠檬酸 )0.006g,Ferric ammonium citrate(柠檬酸铁铵0.006g,EDTA (dinatrium-salt) 0.001g,Na2CO3 0.02g,A5 + Co solution * (A5溶液1000×)1ml Distilled Water (蒸馏水)919ml

SE培养基

NaNO3

0.25g

K2HPO4 . 3H2O

0.075g

MgSO4 . 7H2O

0.075g

CaCl2 . 2H2O

0.025g

KH2PO4

0.175g

NaCl

0.025

Soil extract

40ml

FeCl36H2O

0.005

FeEDTA

1ml

A5 solution 1000×

1ml

distilled water

958ml

Soil Extract(土壤提取液)配置方法

取花园土未施过肥0.5kg置于烧杯或三角瓶中,加入蒸馏水1000毫升,瓶口用透气塞封口,在水浴中沸水加热2小时,冷却数小时,在无菌条件下过滤,取上清液,将灭菌蒸馏水加入上清液至总体积1000毫升。土壤提取液保存在4ºC备用。

Composition of the A5 solution

Add to 100 ml of distilled water:(加入100ml 的蒸馏水)

H3BO3

286 mg

MnCl2 . 4H2O

181 mg

ZnSO4 . 7H2O

22 mg

CuSO4 . 5 H2O

7.9 mg

(NH4)6Mo7O24 .4H2O

3.9 mg

EDTA-Fe的配置方法:

将EDTA和FeCl36H2O分别溶于水和HCl(0.1N),混匀即可。

Na2EDTA

1g

distilled water

50ml

FeCl36H2O

81 mg

HCl(0.1N)

50ml

Pr培养基

Preparation: to 997 mL of glass-distilled water, add 1.0 g proteose peptone, 15.0 g agar, and the following stock solutions:

working solution

g/1000 mL H2O

NaNO3

0.25

CaCl2. 2H2O

0.025

MgSO4. 7H2O

0.075

K2HPO4

0.075

KH2PO4

0.175

NaCl

0.025

A5 solution

1ml

EDTA-Fe

1ml

FeCl3 (0.05%)

1ml

A5溶液和EDTA-Fe溶液配制方法同上。

真菌培养基

萨市(Sabouraud’s)培养基

蛋白胨10g,琼脂20g,麦芽糖40g,水1000ml

先把蛋白胨、琼脂加水后,加热,不断搅拌,待琼脂溶解后,加入40g麦芽糖(或葡萄糖),搅拌,使它溶解,然后分装,灭菌,备用。

本培养菌是培养许多种类真菌所常用的。

马铃薯糖琼脂培养基

把马铃薯洗净去皮,取200g切成小块,加水1000ml,煮沸半小时后,补足水分。在滤液中加入10g琼脂,煮沸溶解后加糖20g(用于培养霉菌的加入蔗糖,用于培养酵母菌的加入葡萄糖),补足水分,分装,灭菌,备用。

把这培养基的pH值调到7.2-7.4,配方中的糖,如用葡萄糖还可用来培养放线菌和芽孢杆菌。

豆芽汁培养基

黄豆芽100g,琼脂15g,葡萄糖20g,水1000ml

洗净黄豆芽,加水煮沸30分钟。用纱布过滤,滤液中加入琼脂,加热溶解后放入糖,搅拌使它溶解,补足水分到1000ml,分装,灭菌,备用。

把这培养基的pH值调到7.2-7.4,可用来培养细菌和放线菌。

豌豆琼脂培养基

豌豆80粒,琼脂5g,水200ml

取80粒干豌豆加水,煮沸1小时,用纱布过滤后,在滤液中加入琼脂,煮沸到溶解,分装,灭菌,备用。

食用菌菌种培养基

马铃薯-蔗糖-琼脂培养基

20%马铃薯煮汁1000ml,蔗糖20g,琼脂18g

把马铃薯洗净去皮后,切成小块。称取马铃薯小块200g,加水1000ml,煮沸20分钟后,过滤。在滤汁中补足水分到1000ml,即成20%马铃薯煮汁。在马铃薯煮汁中加入琼脂和蔗糖,煮沸,使它溶解后,补足水分,分装,灭菌,备用。使用该培养基对pH值要求不严格,可以不测定。

综合马铃薯培养基

20%马铃薯煮汁1000ml,磷酸二氢钾3g,硫酸镁1.5g,葡萄糖20g,维生素10mg,琼脂18g

先配制20%马铃薯煮汁,方法同上。在煮汁中加入上述各种组分,加热溶解后补足水分,调整pH值到6。分装,灭菌,备用。 该培养基用于培养和保存灵芝、平菇、香菇等食用菌菌种。

烟草的培养基

在植物组织培养时,通过调节IAA和CTK的比值能影响愈伤组织分化出根或芽。CTK/IAA高时,愈伤组织分化芽。

CTK/IAA低时,分化根;CTK/IAA比例适中维持愈伤组织不分化。

愈伤组织诱导培养基制备

以MS培养基母液为基础,向洁净铝锅中顺序加入大量元素20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,铁盐100×母液20mL ,维生素100×母液20mL,肌醇200×母液10mL,甘氨酸200×母液10mL,配制得MS培养基后,再加入0.5mgL-1的BA8mL,0.5mgL-1的NAA8mL。然后加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水,加入40g蔗糖后搅拌使其溶化,用0.5molL-1的NaOH和0.5 molL-1的HCl调整pH值至5.8-6.0。加入14g琼脂,将铝锅置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化,然后用蒸馏水定容至终体积2L,继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中。

烟草叶片愈伤组织诱导取一无菌培养皿,用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中,并用解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片,然后将其接种于准备好的培养基上,每瓶接种5小片,一共接种6瓶。接种后的三角平置于24条件下黑暗培养1周,然后在同样温度下有光照和全黑暗下培养3周直至愈伤组织形成(两种情况各置3瓶)。观察愈伤组织诱导结果,统计愈伤组织诱导率。

器官分化及植株再生培养

将诱导的愈伤组织按类型分别转入分化培养基上,置于连续光照,温度20-22℃条件下培养3周,统计愈伤组织再生植株情况。

愈伤组织诱导的总体情况

烟草愈伤组织诱导培养4周后,愈伤组织基本形成,即排除因生长时间不够而未形成愈伤的情况。具体情况见表一中所示。6瓶培养物均有愈伤形成,且都未发生污染,但诱导率几乎各不相同。其中, 在光照条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为60.0,在黑暗条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为46.7%。由于实验过程中,外植体即烟草叶片取得偏小,接种时可能已有部分外植体的大部分细胞脱水死亡,使整个实验的愈伤组织诱导率偏低,愈伤块偏小。

动物细胞培养基

RPMI1640培养基是一个全营养型培养基,广泛应用于哺乳动物细胞和杂交瘤细胞的培养,如人骨髓瘤细胞、鼠杂交瘤细胞、人白细胞以及B细胞和T细胞。最初设计用于悬浮细胞培养和人白血病细胞的单层细胞培养。

选择性培养基

选择性培养基是指根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基。其功能是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌,从而提高该菌的筛选效率。

酵母菌富集培养基

葡萄糖5%,尿素0.1%,硫化铵0.1%,磷酸二氢钾0.25%,磷酸氢二钠0.05%,七水合硫酸镁0.1%,七水合硫酸铁0.01%,酵母膏0.05%,孟加拉红0.003%,pH4.5

Ashby无氮培养基

富集好氧自生固氮菌

甘露醇1%,磷酸二氢钾0.02%,七水合硫酸镁0.02%,氯化钠0.02%,二水合硫酸钙0.01%,碳酸钙0.5%

EMB培养基

常用于鉴别E.coli

蛋白胨10g,乳糖5g,蔗糖5g,磷酸氢二钾2g,伊红Y0.4g,美蓝0.065g,蒸馏水1000g,pH7.2

2216E培养基配方

分离海洋微生物的培养基配方

蛋白胨5g,酵母膏1g,磷酸高铁0.01g,琼脂15-20g,陈海水1000ml,煮沸氢氧化钠(5%)的溶液调PH值7.6-7.8

伊红美蓝培养基

可用于检测水中大肠杆菌的含量

首先按以下组成配制基础培养基。

蛋白胨10g,NaCl5g

琼脂15-20g

将上述物质溶解后,用蒸馏水定容至1000mL,调节pH为7.6。灭菌后,冷却至60℃左右,再按下面的比例,在无菌操作条件下加入灭菌的乳糖溶液、伊红水溶液以及美蓝水溶液。摇匀后,立即倒平板。溶液中的乳糖在高温下会破坏,因此一般使用压力为70kPa、温度为115℃的条件灭菌20分钟。

基础培养基100mL,20%乳糖溶液2mL

2%伊红水溶液2mL,0.5%美蓝水溶液1mL

天然培养基是指来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基,如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等。组织培养技术建立早期,体外培养细胞都是利用天然培养基。但是由于天然培养基制作过程复杂、批间差异大,因此逐渐为合成培养基所替代。广泛使用的天然培养基是血清,另外各种组织提取液、促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少。

血清种类

目用于组织培养的血清主要是牛血清,培养某些特殊细胞也用人血清、马血清等。选择用牛血清培养细胞的原因:来源充足、制备技术成熟、经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解。牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的,但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适。

牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。牛血清分为小牛血清、新牛血清、胎牛血清。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛;新牛血清取自出生24小时之内的新生牛;小牛血清取自出生10-30天的小牛。显然,胎牛血清是品质最高的,因为胎牛还未接触外界,血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。

血清的主要成分血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已知,但还有一部分尚不清楚,且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等,这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。

血清主要作用

1. 提供基本营养物质:氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等,是细胞生长必须的物质。

2. 提供激素和各种生长因子:胰岛素、肾上腺皮质激素(氢化可的松、地塞米松)、类固醇激素(雌二醇、睾酮、孕酮)等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。

3. 提供结合蛋白:结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质,如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等,转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。

4. 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。

5. 对培养中的细胞起到某些保护作用:有一些细胞,如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶,血清中含有抗蛋白酶成分,起到中和作用。这种作用是偶然发现的,则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械损伤,特别是在悬浮培养搅拌时,粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子,他们在代谢解毒中起重要作用,如SeO3、硒等。

血清培养基主要问题

1. 血清的成份可能有几百种之多,对其准确的成份、含量及其作用机制不清楚,尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识,这给研究工作带来许多困难。

2. 血清都是批量生产,各批量之间差异很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保证每批血清的相似性极为困难,从而使实验的标准化和连续性受到限制。

3. 对大多数细胞,在体内状态,血清不是它们接触的生理学液体,只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清,因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态,血清可能促进某些细胞的生长(成纤维细胞)同时抑制另一类细胞生长(表皮细胞)。

4. 血清含一些对细胞产生毒性的物质,如多胺氧化酶,能与来自高度繁殖细胞的多胺反应(如精胺、亚精胺)形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长,甚至造成细胞死亡。

5. 动物个体不同,血清产地、批号不同,每批质量差异甚大,其成分不能保持一致。

6. 取材中可能带入支原体、病毒,对细胞产生潜在影响,可能导致实验失败或实验结果不可靠性。

7. 大规模生产中,血清来源越来越困难,价格昂贵,是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。

血清的质量标准

血清质量高低取决于两方面因素:一是取材对象,二是取材过程。用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内,取材过程应严格按照操作规程执行,制备出的血清要经过严格的质量鉴定。WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求:

1. 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家。并应具备适当的监测系统。

2. 有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群。

3. 证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物。

4. 血清要通过滤膜过滤除菌,保证无菌。

5. 无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染,有些国家要求无细菌噬菌体污染。

6. 对细胞有良好的支持繁殖作用。

我国在对牛血清的质量2000年版《中国生物制品主要原辅料质控标准》中提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量,细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素,支持细胞增殖检查。

一、配制用水

培养基的大部分是水,所以水的质量直接影响培养基的质量。按Waymouth标准,水的电阻应为200万欧姆,一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的

双蒸水或三蒸水可以符合使用条件。

二、培养基

培养基有天然、人工两种。一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基,以双蒸或三蒸水配制。NaHCO3(或HCl)调pH至7.2-7.4,若pH值超过7.6或远低于6.8,则大多数细胞不能生长。RPMI-1640不耐高压灭菌,使用前需经灭菌0.22μm孔径滤膜滤过处理。

三、血清

培养中常使用小牛血清(或胎牛血清)。血清亦不能高压灭菌,无菌的小牛血清需在56℃水浴30分钟灭活补体,置4℃冰箱存放待用。配制时含量视培养细胞种类、时间而定,一般用1015%。由于血清成分复杂、条件不易控制,可选用无血清培养基。

四、抗菌素

为防止培养时期细菌的污染,可在培养基中添加适当抗菌素,一般用量与组织细胞培养相同:卡那霉素100单位/毫升,或双抗--青霉素100单位/毫升,链霉素100微克/毫升。

五、植物血凝素(PHA)

非增殖期的细胞不能制备染色体,如人外周血淋巴细胞,但在离体培养过程中,在PHA的作用下,可被刺激转化为淋巴母细胞而进入有丝分裂。

经实验测定其分裂高峰分别于培养后44-48小时和68-72小时。

PHA有粘多糖,蛋白质两种重要成分。粘多糖促使有丝分裂,蛋白质起凝集作用。PHA激活的细胞数随其浓度而增加,直至全部免疫活性细胞均

被激活为止,但PHA浓度过高会引起凝集,一般采用4%浓度为好。

培养基配方的选定

同一种培养基的配方在不同著作中常会有某些差别。因此,除所用的是标准方法,应严格按其规定进行配制外.一般均应尽量收集有关资料.加以比较核对.再依据自己的使用目的加以选用,记录其来源。

培养基的制备记录

每次制备培养基均应有记录,包括培养基名称,配方及其来源.和各种成份的牌号。最终pH值、消毒的温度和时间制各的日期和制备者等,记录应复制一份,原记录保存备查,复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。

培养基成分的称取

培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱.最好一次完成,不要中断。可将配方置于傍侧,每称完一种成分即在配方上做出记号,并将所需称取的药品一次取齐,置于左侧,每种称取完毕后,即移放于右侧。完全称取完毕后.还应进行一次检查。

培养基各成份的混合和溶化

培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅,以防有微量铜或铁混入培养基中,使细菌不易生长。最好使用不锈钢锅加热溶化,也可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动,以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用,应重新制备。待大部分固体成分溶化后,再用较小火力使所有成分完全溶化。迄至煮沸。如为琼脂培养基,应先用一部分水将琼脂溶化,用另一部分水溶化其它成分,然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中,因蒸发而丢失的水分,最后必须加以补足。

培养基pH 的初步调整

培养基各成分完全溶解后,应进行pH的初步调正,因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化,例如,牛肉浸液约可降低pH0.2。而肠浸液pH却会有显著的升高。因此,对这个步骤,操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终pH,保证培养基的质量。pH调正后,还应将培养基煮沸数分钟,以利培养基沉淀物的析出。

培养基在使用前通过高压或过滤灭菌。防止污染应该注意以下事项:

确认工作细胞库是否被污染,确认毒种工作种子批是否被污染,确认所用培养基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染,均可用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。实际生产中,可以从配制好的培养液中取少量加入营养琼脂于恒温培养箱内培养,48小时即可观察有无污染。

其它:高压灭菌设备、过滤除菌设备均应进行验证,确保灭菌和除菌效果;前者应在投产前及其后的每6个月进行验证,后者应在每次除菌前、后进行验证工作(至少应在除菌后进行一次)。

另外,应将有毒区与无毒区严格分开,并有各自独立的空气净化系统及孵室,有毒区对无毒区应保持相对负压,防止病毒对培养细胞(尤其是细胞库)的污染。


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