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实时荧光定量pcr仪

实时荧光定量pcr仪,由荧光定量系统和计算机组成,用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平,这就是分析荧光数据的水平。

实时荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件,构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值(限制点的循环数)。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大,这样可以获得最准确,可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品,线性回归分析将产生一条标准曲线,可以用来计算未知样品的浓度。

所谓real-time Q-PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在 real-time 技术的发展过程中,两个重要的发现起着关键的作用:(1)在90年代早期,TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光记探针,因此使得间接的检测PCR产物成为可能。(2)此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的,随着反应循环数的增加,最终PCR反应不再以指数方式生成模板,从而进入平台期。在传统的PCR 中,常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物,因此用此终点法对PCR产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲 线。在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在PCR反应处于指数期的某一点 上来检测PCR产物的量,并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较,在real-time Q-PCR反应的指数期,首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 (baseline),荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号,它可用于定义 样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,因此只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样 品的起始拷贝数。

⑴ 病原体检测

目前,采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。

如:结核菌基因诊断的意义主要表现在:

a.区分TB与其它分枝杆菌;

b.检测TB耐药基因;

c.提高TB的阳性检出率。

⑵ 产前诊断

到目前为止,人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗,只能通过产前监测,减少病婴出生,以防止各类遗传性疾病的发生,如为减少X连锁遗传病患儿的出生,从孕妇的外周血中分离胎儿DNA,用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法,易为孕妇所接受。

⑶ 药物疗效考核

对乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV) 定量分析显示:病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达,干扰素治疗作用不敏感,而HCV低滴度,干扰素作用敏感;在拉米夫定治疗过程中,HBV-DNA的血清含量曾有下降,随后若再度上升或超出以前水平,则提示病毒发生变异。如PCR技术在HBV检测中的应用及意义:

a.了解乙肝病毒在体内存在的数量。

b.是否复制。

c.是否传染,传染性有多强。

d.是否有必要服药。

e.肝功能异常改变是否由病毒引起。

f.判断病人是适合用哪类抗病毒药物。

g.判断药物治疗的疗效。

⑷ 肿瘤基因检测

尽管肿瘤发病的机理尚未清楚,但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变,在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变,而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现,荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。

在优生优育中的应用

近年来经济发展迅猛,人民生活水平逐年提高,对自身及家人特别是下一代的身体健康愈来愈重视。另外,由于国内计划生育工作逐步走向深化,独生子女比较多,孩子的身体素质更成为长辈们关注的焦点。因此,怎样提高新生儿质量改善人类遗传素质,即优生优育已显得非常重要。①避免有严重遗传性疾病和先天性疾病的个体出生。②增进体力、智力优秀个体的繁衍。其中避免有严重遗传性疾病及先天性疾病个体出生是优生优育最基本的内容。从临床优生学角度分析具体工作包括在母亲妊娠期间对母亲及胎儿进行遗传学检查尽量排除常见的遗传性疾病个体的出生,另外在妊娠期检查母亲是否患有某些易引起胎儿畸形的传染性疾病如弓型虫、风疹病毒、衣原体等感染。以往对遗传性疾病的检测主要使用染色体分析法,而临床绝大部分遗传性疾病是基因病而不是染色体病,染色体发析法不能检出的。若使用PCR基因扩增法联合单链构型多态性分析(sscp)、限制性片段长度多态性分析(RFCP)等位基因特异性寡核某酸(Aso)点杂交或差异PCR可以很方便地检出单个基因的突变而且其准确性可达95%以上,因此使这一问题得到了较好的解决。常见的易致胎儿畸形的感染性疾病原体主要有单疱病毒(HSVⅡ)、风疹病毒(RV)、人巨细胞病毒(HCMV)、弓形体(TOX)及沙眼衣原体(CT)。以往这些病原体感染诊断比较困难,主要靠培养法进行确诊,而培养法费时,代价昂贵,而且受到采样、样本保存及用药等因素的影响,基本不能在临床中推广。PCR基因扩增法因其高敏感性、高特异性非常适合这些疾病诊断及疗效跟踪,是最值得推荐的检验方法。

扩增法

在遗传性疾病产前诊断中的应用

PCR基因扩增法在遗传性疾病产前诊断中的应用,遗传病是由于遗传物变化而引起的机体某一功能或缺陷或异常所致的疾病,其根本变化在于遗传物质。其类型包括单基因遗传病,染色体遗传病及多基因遗传病。遗传病诊断除询问病史,一般物理诊断,普通实验室检查及了解症状、体征外有特殊性。过去常应用系谱分析,染色体及性染色色质检验作为遗传病诊断的主要依据,再辅以相关的酶学分析从而作出诊断。随着分子生物不的迅速发展及其在遗传性病诊断中的广泛应用,基因诊断技术诞生,基因诊断技术为遗传病的临床诊断起了很大的促进作用。聚合酶链反应(PCR)技术是基因诊断主要技术之一。这种快速、灵敏的基因体外扩增技术与多种分子生物学手段相配合可以检出大部分已知的基因突变、基因缺失、染色体错位等,PCR技术日益成为遗传病诊断的最有效、最可靠的方法之一。以下举几个在国内有普遍意义的例子。

PCR检测地中海贫血

地中海贫血(Thalassemia)是一种遗传性慢性溶血性贫血病,是世界上最常见且发病比最高的一种单基因遗传病。在两广、贵州、四川等地发病率较高,在广西等地高达15%。地中海贫血是由于基因突变造成珠蛋白的不平衡,使结构正常的肽链合成量减少甚至没有合成表现为溶血性贫血。接受累基因种类分为α、β、γ等,其中以 α、β地贫为最常见,危害了最大。珠蛋白基因簇位于人6号染色短臂上,有两个重复基因基因位于α1、α2、两个α基因及其旁侧序列有很大的同源性,易出现染色体不等交换,导致α基因缺失-α地贫。α地贫基因部分缺失有α1基因部分缺失、α2基因缺失、α1及α2基因同时缺失及非缺失型地贫。可以应用PCR技术扩增α1、α2基因从而检测这些基因是否缺失、突变等,从而对α型地中海贫血作出诊断。β地中海贫血基因缺陷主要表现为基因序列中单一核苷酸的突变,或少数碱基的缺失、插入,使正常β珠蛋白肽链合成减注或缺失。应用位点特异性寡核苷探针(Aso)进行PCR产物斑点杂交即可对其作出诊断。

苯丙酮尿症

苯西酮尿症(PKU)是一种常染色体隐性遗传病,患者因苯丙酸羟化酶转化为酷氨酸,使苯氨酸及其代谢物在体内大量蓄积,出现脑组损伤及不可逆性智力发育障碍。PKU患者出生时正常,新生儿一经确诊为PKU停止母乳喂养采用低苯丙氨酸钦食疗法810年,可使患者智力水平发展维持正常。由于低苯丙氨酸钦食非常昂贵,一般家庭难以承受,因此,施行产前诊断,防止患儿出生是最好的选择。PAH只在肝细胞中表达,不能用血细胞,成纤维细胞、羊水、绒毛细胞进行酶活性分析,只能进行基因诊断。PKU的基因变化并非全部PAH基因的缺失,而是以点突变为主要表现形式,而且其突变位点很多。必须使用PCR扩增结合,ASO,SSCP或使用扩增片段长度多态性分析(AmpFLA)进行检测,这些技术都较复杂,检验人员须经专业培训。

血友病

血友病是一组最为常见的遗传性凝血障碍,根据因子缺陷的不同分为甲、乙两型,(Ⅷ、Ⅸ因子缺陷),也有复合型血友病,但不常见。甲型血友病发病率为1/10000,Ⅷ因子基因位于G6PD基因附近,全长186Kb,大范围的基因重排(缺失、插入、重复)导致甲型血友病的病例很少,仅为Ⅷ因子缺陷的5%,大部分病人表现为单个或少数碱基的突变。由于Ⅷ因子基因长度为186Kb,突变位点多,而且新生突变频率高,从临床角度讲不能对每一个突变都检测,可对最为常见的几种突变类型进行检测,主要的检测手段是PCR结合RELP分析。乙型血友病发病率占血友病的20%,其基因变化及检测方法与甲型血友病类似。

性别发育异常

区别雄性及雌性的物质基础是性染色体,哺乳动物胚胎发育中,雌性表型不需要任何调节,而雄性表型则由多因素决定,位于Y染色体上的指导雄性性别分ss化的基因命名为睾丸决定因子(TDF)。现代研究表明,SRY(Sex-determining region of Y chromosome)基因是TDF基因,位于Y染以体短臂末端。SRY区缺失易导致46XY核型个体发育成女性。进行基因检测可以检出SRY基因组的易位及缺失,从而诊断性别发育异常,这一探索性别异常的研究非常热门。另外还有一种46XY核型异常的病人即睾丸女性化,这是用于雄激素受体(androgen receptor,AR)基因缺欠,使雄激素的靶基因对雄激素不应答就答或不全而引起的,根据病情的不同有不同的表型,AR缺陷有很高的新生突变频率,表现为无家族史的散发病。AR基因长90Kb,位于X染色体上,AR基因异常大部分为个别基因碱基的突变,可以通过PCR结合ASO或SSCP检出。

脆X综合征

脆X综合片(fragile-X Syndrome,Frax)是发病率最高的一种X-连锁的智力低下综合症(X-linked mental retardation XLMR)。因这种综合症与X染色体上的脆位点连锁而得名。大多数FRAX男性智商(IQ)低于50,并有随着年龄增长而下降的趋势。用人工酵母染色体(artificial yeast chromosome,YAC)克隆技术分离获得覆盖X-脆位点区域的YAC克隆,在这一克隆中获得一个能在人脑中表达的基因命名为FMR-1(fragile X mentai retardation-1),FMR-1的5‘端有一个CGG(精)三核苷酸串(CGG)n,正常人群中(CGG)n中存在多态性,重复序列为6-46个,当重复超过52个时,此区域的分裂呈不稳定,导致重复序列大幅度增加,无临床表现的携带者插入片段长度小于500bg,有临床表现者,长度都大于600BP而且伴有甲基化。人们将500bp作为前突变与全突变的分界线。对Frax的诊断以前用细胞遗传学的方法检测脆位点,实验条件严格,成功率不高。现在采用分子遗传学方法即可诊出前突变及全突变。用PCR扩增CGG重复序列,检测扩增产物的长度。突变基因的扩增片段增大,体细胞异质性时出现多条长度不等的扩增带甚至拖尾成一片,或者因为扩充的全突变插入片段过长超出PCR扩增能力而结果无扩增现象。

在“Torsch”诊断中的应用

PCR基因扩增法在“Torsch”诊断中的应用,在妊娠早期(1-3个月),有些病原微生物的感染易导致胎儿畸形,这些病原体中最常见的有弓体(TOX)、风疹病毒(RV)、单纯疱疹病毒(HSV)、沙眼衣原体(CT)、及巨细胞(HCMV),对这几种病原体的检测根据其英文词首简称为Torsch试验。

弓形体的PCR检测

弓形体有广泛的自然疫原性,人体多为隐性感染,抵抗力低时可以有临床表现。弓形体的诊断较困难,血清学方法敏感性较高但有交叉性出现假阳性而且无法确定近期感染、远期感染或一过性感染。确诊的方法是活组织检查或动物接各,这些方法阳性率太低不能推广。PCR检测可以检出样本中1-2个病原体而且准确性高,是目前对弓形体检测最优秀的方法。作为优生优育检查应于妊娠前或妊娠早期取全血样本,可以用EDTA或肝素抗凝,以EDTA抗凝效果最好,检测外周血白细胞中是否有TOX存在。对于不孕,多次自然流产或养小动物的产期妇女,作弓形虫检测有更重要的临床意义。

风疹病毒感染

风疹病毒(RV)是一种单股正极性RNA病毒,人是风诊病毒的唯一宿主。RV感染可以引起胎儿的畸形,影响胎儿免疫系统的发育,因此RV检测在优生优育工作中显得非常重要。RV检测可以用直接培养法及IgM抗体测试法。培养法费时很长而且常受到其它病毒的干扰,IgM测定法结果了不太准确,PCR法敏感性及特异性都很高而且简便快速,是RV感染最优秀的测试方法之一。风疹病毒侵入体内后在上呼吸道增殖而出现症状,面部出现丘疹,迅速遍及全身。样本采用妊娠母亲的咽部拭子、血清、产妇的绒毛或妊娠如羊水等。RV病毒是RNA病毒,PCR扩增较复杂,应注意样本的采集时机,操作的准确性。

单纯疱诊病毒

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)是一种DNA病毒,可引起多器官的炎症,可通过性接触传播。HSVⅡ感染复发率高,80%的感染者于12个月内复发。HSV感染后经机体免疫系统清除,少数病人终生携带,体弱时复发。PCR法检测HSV敏感性高而且可以直接对HSVⅠ/Ⅱ型进行分型鉴定。

沙眼衣原体

沙眼衣原体(CT)不仅能引起沙眼而且能引起生殖器感染,是一种性传播性疾病。与淋病(NG),梅毒等经典性传播性疾病不同,CT易经其它接触途径传播,少数地区对妊娠期妇女普查结果表明此人群中发病率高达20%-30%。在欧美等国家CT的感染已超过淋病而居性传播性疾病之首。衣原体感染常呈无症性或非特异性症状的隐性感染,不容易诊断。以往用培养法进行确诊,费时且敏感性、准确性都不足。PCR用于CT检测时应注意不同检测目的的取材不同,对于性传播性疾病诊断应取生殖道分泌物(查脱落细胞),而对于早期妊娠病人应查其全血样本,在妊娠后期或临产时再查阴道分泌物以便指导生育时产道清理。

人巨细胞(HCMV)

HCMV感染十分普遍,除少数原发性感染发生原发性单核细胞增多症外,极大多数为隐性感染。HCMV可以长期潜伏在体内,当机体免疫功能低下时,病毒会激活而造成严重疾病在妊娠期如果孕妇感染HCMV可以引起早产、畸形、死胎及新生儿巨细胞包涵体病等。HCMV属疱疹病毒科,可以从唾液、尿、宫颈分泌物及乳汁排出。HCMV“金标准”的诊断试验是用单层成纤维细胞作病毒培养,其它的实验检查有血清学的检测及包涵体检测。PCR是HCMV检测的一种新方法,用于检测的样本有血,生殖道分泌物拭子等,用于优生优育检测时应取血样本。对于早期妊娠病人若有HCMV感染应再检测羊水,或其它妊娠物,对病人认真及进跟踪检查,综合判断并采取相应的医疗措施。

PCR应用于优生优育有很大的优越性,使这一技术的推广应用刚刚起步,应注意操作的准确性,尽量避免误诊。对感染性疾病首先应取孕妇血样检测,有可疑时或血中检出病原体核酸时应尽早作羊水等妊娠物检查。不管是否怀疑胎儿有严重遗传病倾和中或有感染引起的畸形风险,对胎儿的去留应尊重胎儿父母亲的意见。

部分应用

新药开发研究,人用药物及其他药物

针对一些感染性疾病的药物,如各种病毒病、细菌病等,在新药的开发过程中,快速了解药物对疾病进程的影响可以为新药开发节约大量的人力、时间和资金,与以前所用的Elisa等方法相比,实时荧光定量PCR技术可以快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量,因此有利用分析药物的作用效果,为比较不同的配方的疗效、用药量、用药时间等等提供快速、定量的评价。

此方法除了用于人用药物以外,还可以用于畜用药物,甚至其他经济动物及植物的药物研究等,因此其在药物研究方面的应用范围是很广的。

超早期感染用药物及疗法的研究与开发

实时荧光定量PCR方法测定是血液中病毒核酸的含量,因此不必等到病人体内产生抗体,同时,由于其灵敏度与Elisa相比不可同日而语,在病毒感染的早期,即血液中病毒含量很低时就可以测定。因此就出现了一个新的领域,即在病毒或细菌含量很低时如何用药,用什么药以及用药量等进行研究,为将疾病消灭在超早期作出贡献。

药物疗效研究,人用药物及其他药物

对于一些已经上市的新药或是应用了很长时间的老药,其用药的效果以及用药量及用药时间都可以进行进一步的研究,为更加合理化的应用这些药物为人类造福进行进一步的研究。以前所用的方法由于不能准确定量,灵敏度也不够,因此有很多需要研究的内容没有完成。这一方面需要研究内容很多,意义也很大。

新的愈后指标的研究

对于感染性疾病,在药物作用至一定程度后,就认为可以停药了,但是应该在什么停药,现在大都没有一个明确的指标,现在所用的指标由于受到检测方法的灵敏度及准确性限制,这一指标未必合理,因此有必要对治愈的指标以及指标与复发率以及疾病转化为其他疾病之间的关系等进行进一步的研究,从而为药物或疗法彻底治愈疾病打下坚实的理论基础。

新诊断及检验试剂的开发

现有的很多诊断及检验方法都不能同时满足快速、灵敏、定量的要求如现有培养法、Elisa法等等,而荧光定量PCR方法以则可以做到这一点,从而可为临床疾病、商检、粮油检验、食品检验、血液检验等等开发新的试剂,从而提高检验的灵敏度、速度及准确性等;这类试剂的种类是非常多的,所开发的试剂的社会效益及经济效益都是很巨大的。

血液检验漏检率

由于实时荧光定量PCR方法比Elisa灵敏很多,因此,血站或血液研究所一般用来研究Elisa方法的漏检率,即分析Elisa方法测定为阴性的血样,再用实时荧光定量PCR方法来复检。复检时,一般24个Elisa阴性的血样混合成一个样本进行检测。上海用此方法在用于血液制品的血液中发现一例HIV,后经测定供血者,证实病人的确是HIV阳性。北京市红十字血液中心正在测定北京血站中5万份Elisa阴性血样的漏检率。由于不同地区所用的Elisa试剂、方法、批号等都不相同,因此不同地区都有必要进行这一工作。

由于荧光定量PCR方法的快速、灵敏、定量的特点,其在研究及开发方面的应用是不胜枚举的,如研究个人基因型与药物疗效之间的关系等;研究人员也可以根据自己研究项目开发其新的用途。


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