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电子显微镜

电子显微镜,简称电镜,英文名Electron Microscope(简称EM),经过五十多年的发展已成为现代科学技术中不可缺少的重要工具。电子显微镜由镜筒、真空装置和电源柜三部分组成。

电子显微镜技术的应用是建立在光学显微镜的基础之上的,光学显微镜的分辨率为0.2μm,透射电子显微镜的分辨率为0.2nm,也就是说透射电子显微镜在光学显微镜的基础上放大了1000倍。

电子显微镜由镜筒真空装置源柜三部分组成。

镜筒主要有电子源、电子透镜、样品架、荧光屏和探测器等部件,这些部件通常是自上而下地装配成一个柱体。

电子透镜用来聚焦电子,是电子显微镜镜筒中最重要的部件。一般使用的是磁透镜,有时也有使用静电透镜的。它用一个对称于镜筒轴线的空间电场或磁场使电子轨迹向轴线弯曲形成聚焦,其作用与光学显微镜中的光学透镜(凸透镜)使光束聚焦的作用是一样的,所以称为电子透镜。光学透镜的焦点是固定的,而电子透镜的焦点可以被调节,因此电子显微镜不像光学显微镜那样有可以移动的透镜系统。现代电子显微镜大多采用电磁透镜,由很稳定的直流励磁电流通过带极靴的线圈产生的强磁场使电子聚焦。电子源是一个释放自由电子的阴极,栅极,一个环状加速电子的阳极构成的。阴极和阳极之间的电压差必须非常高,一般在数千伏到3百万伏特之间。它能发射并形成速度均匀的电子束,所以加速电压的稳定度要求不低于万分之一。

样品可以稳定地放在样品架上,此外往往还有可以用来改变样品(如移动、转动、加热、降温、拉长等)的装置。

探测器用来收集电子的信号或次级信号。

真空装置用以保障显微镜内的真空状态,这样电子在其路径上不会被吸收或偏向,由机械真空泵、扩散泵和真空阀门等构成,并通过抽气管道与镜筒相联接。

电源柜由高压发生器、励磁电流稳流器和各种调节控制单元组成。 [1]

电子显微镜按结构用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、反射式电子显微镜和发射式电子显微镜等。

透射式电子显微镜常用于观察那些用普通显微镜所不能分辨的细微物质结构;扫描式电子显微镜主要用于观察固体表面的形貌,也能与X射线衍射仪或电子能谱仪相结合,构成电子微探针,用于物质成分分析;发射式电子显微镜用于自发射电子表面的研究。

因电子束穿透样品后,再用电子透镜成像放大而得名。它的光路与光学显微镜相仿,可以直接获得一个样本的投影。通过改变物镜的透镜系统人们可以直接放大物镜的焦点的像。由此人们可以获得电子衍射像。使用这个像可以分析样本的晶体结构。在这种电子显微镜中,图像细节的对比度是由样品的原子对电子束的散射形成的。由于电子需要穿过样本,因此样本必须非常薄。组成样本的原子的原子量、加速电子的电压和所希望获得的分辨率决定样本的厚度。样本的厚度可以从数纳米到数微米不等。原子量越高、电压越低,样本就必须越薄。样品较薄或密度较低的部分,电子束散射较少,这样就有较多的电子通过物镜光栏,参与成像,在图像中显得较亮。反之,样品中较厚或较密的部分,在图像中则显得较暗。如果样品太厚或过密,则像的对比度就会恶化,甚至会因吸收电子束的能量而被损伤或破坏。

透射电镜的分辨率为0.1~0.2nm,放大倍数为几万~几十万倍。由于电子易散射或被物体吸收,故穿透力低,必须制备更薄的超薄切片(通常为50~100nm)。

透射式电子显微镜镜筒的顶部是电子枪,电子由钨丝热阴极发射出、通过第一,第二两个聚光镜使电子束聚焦。电子束通过样品后由物镜成像于中间镜上,再通过中间镜和投影镜逐级放大,成像于荧光屏或照相干版上。中间镜主要通过对励磁电流的调节,放大倍数可从几十倍连续地变化到几十万倍;改变中间镜的焦距,即可在同一样品的微小部位上得到电子显微像和电子衍射图像。 [2]

扫描电子显微镜的电子束不穿过样品,仅以电子束尽量聚焦在样本的一小块地方,然后一行一行地扫描样本。入射的电子导致样本表面被激发出次级电子。显微镜观察的是这些每个点散射出来的电子,放在样品旁的闪烁晶体接收这些次级电子,通过放大后调制显像管的电子束强度,从而改变显像管荧光屏上的亮度。图像为立体形象,反映了标本的表面结构。显像管的偏转线圈与样品表面上的电子束保持同步扫描,这样显像管的荧光屏就显示出样品表面的形貌图像,这与工业电视机的工作原理相类似。由于这样的显微镜中电子不必透射样本,因此其电子加速的电压不必非常高。

扫描式电子显微镜的分辨率主要决定于样品表面上电子束的直径。放大倍数是显像管上扫描幅度与样品上扫描幅度之比,可从几十倍连续地变化到几十万倍。扫描式电子显微镜不需要很薄的样品;图像有很强的立体感;能利用电子束与物质相互作用而产生的次级电子、吸收电子和X射线等信息分析物质成分。 [3]

扫描电子显微镜的制造是依据电子与物质的相互作用。当一束高能的入射电子轰击物质表面时,被激发的区域将产生二次电子、俄歇电子、特征x射线和连续谱X射线、背散射电子、透射电子,以及在可见、紫外、红外光区域产生的电磁辐射。同时,也可产生电子-空穴对、晶格振动(声子)、电子振荡(等离子体)。 [3]

一般来讲的数码显微镜严格来说应该属于光学显微镜的范畴。数码显微镜是将精锐的光学显微镜技术、先进的光电转换技术、液晶屏幕技术完美地结合在一起而开发研制成功的一项高科技产品。从而,我们可以对微观领域的研究从传统的普通的双眼观察到通过显示器上再现,从而提高了工作效率。

数码显微镜根据数据显示方式不同可分为两大类:自带屏幕数码显微镜和采用计算机显示的数码显微镜。

自带屏幕数码显微镜,又可分为三类,1.台式数码显微镜;2.便携式数码显微镜;3.无线数码显微镜;台式数码显微镜的主要特点是放大倍率相对较高,可以与电子显微镜媲美;便携式数码显微镜追求的是随处可显微,讲究小巧,

1926年汉斯布什研制了第一个磁力电子透镜

1931年厄恩斯特卢斯卡和马克斯克诺尔研制了第一台透视电子显微镜。展示这台显微镜时使用的还不是透视的样本,而是一个金属格。1986年卢斯卡为此获得诺贝尔物理奖。

1934年锇酸被提议用来加强图像的对比度。

1937年第一台扫描透射电子显微镜推出。一开始研制电子显微镜最主要的目的是显示在光学显微镜中无法分辨的病原体如病毒等。

1938年他在西门子公司研制了第一台商业电子显微镜。

1949年可投射的金属薄片出现后材料学对电子显微镜的兴趣大增。

1960年代投射电子显微镜的加速电压越来越高来透视越来越厚的物质。这个时期电子显微镜达到了可以分辨原子的能力。

1980年代人们能够使用扫描电子显微镜观察湿样本。

1990年代中电脑越来越多地用来分析电子显微镜的图像,同时使用电脑也可以控制越来越复杂的透镜系统,同时电子显微镜的操作越来越简单。 [4]

分辨能力是电子显微镜的重要指标,电子显微镜的分辨能力以它所能分辨的相邻两点的最小间距来表示,即称为该仪器的最高点分辨率:d=δ。显然,分辨率越高,即d的数值(为长度单位)愈小,则仪器所能分清被观察物体的细节也就愈多愈丰富,也就是说这台仪器的分辨能力或分辨本领越强。 [1]

分辨率与透过样品的电子束入射锥角和波长有关。可见光的波长约为300~700纳米,而电子束的波长与加速电压有关。依据波粒二象性原理,高速的电子的波长比可见光的波长短,而显微镜的分辨率受其使用的波长的限制,因此电子显微镜的分辨率(0.2纳米)远高于光学显微镜的分辨率(200纳米)。当加速电压为50~100千伏时,电子束波长约为0.0053~0.0037纳米。由于电子束的波长远远小于可见光的波长,所以即使电子束的锥角仅为光学显微镜的1%,电子显微镜的分辨本领仍远远优于光学显微镜。光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍,而现代电子显微镜最大放大倍率超过300万倍,所以通过电子显微镜就能直接观察到某些重金属的原子和晶体中排列整齐的原子点阵。

单就放大率(magnification)而言,是指被观察物体经电子显微镜放大后,在同一方向上像的长度与物体实际长度的比值。这是两条直线的比值,有人将放大率理解为像与物的面积比,这是一种误解,势必引起概念上的混淆和计算方法与结果上的混乱。

在使用透视电子显微镜观察生物样品前样品必须被预先处理。随不同研究要求的需要科学家使用不同的处理方法。

固定:为了尽量保存样本的原样使用戊二醛来硬化样本和使用锇酸来染色脂肪。

冷固定:将样本放在液态的乙烷中速冻,这样水不会结晶,而形成非晶体的冰。这样保存的样品损坏比较小,但图像的对比度非常低。

脱干:使用乙醇和丙酮来取代水。

垫入:样本被垫入后可以分割。

分割:将样本使用金刚石刃切成薄片。

染色:重的原子如铅或铀比轻的原子散射电子的能力高,因此可被用来提高对比度。

使用透视电子显微镜观察金属前样本要被

切成非常薄的薄片(约0.1毫米),然后使用电解擦亮继续使得金属变薄,最后在样本中心往往形成一个洞,电子可以在这个洞附近穿过那里非常薄的金属。无法使用电解擦亮的金属或不导电或导电性能不好的物质如硅等一般首先被用机械方式磨薄后使用离子打击的方法继续加工。为防止不导电的样品在扫描电子显微镜中积累静电它们的表面必须覆盖一层导电层。

1.在电子显微镜中样本必须在真空中观察,因此无法观察活样本。随着技术的进步,环境扫描电镜将逐渐实现直接对活样本的观察;

2.在处理样本时可能会产生样本本来没有的结构,这加剧了此后分析图像的难度;

3.由于电子散射能力极强,容易发生二次衍射等;

4.由于为三维物体的二维平面投影像,有时像不唯一;

5.由于透射电子显微镜只能观察非常薄的样本,而有可能物质表面的结构与物质内部的结构不同;

6.超薄样品(100纳米以下),制样过程复杂、困难,制样有损伤;

7.电子束可能通过碰撞和加热破坏样本;

8.此外电子显微镜购买和维护的价格都比较高。

电子显微镜技术在肿瘤诊断中的应用

因此,透射电子显微镜突破了光学显微镜分辨率低的限制,成为了诊断疑难肿瘤的一种新的工具。有研究报道,无色素性肿瘤、嗜酸细胞瘤、肌原性肿瘤、软组织腺泡状肉瘤及神经内分泌肿瘤这些在光镜很难明确诊断的肿瘤,利用电镜可以明确诊断电镜主要是通过对超微结构的精细观察,寻找组织细胞的分化标记,确诊和鉴别相应的肿瘤类型。细胞凋亡与肿瘤有着密切的关系,电镜对细胞凋亡的研究起着重要的作用,因此利用电镜观察细胞的超微结构病理变化和细胞凋亡情况,将为肿瘤的诊断和治疗提供科学依据。

电子显微镜技术在肿瘤鉴别诊断中的应用

透射电子显微镜观察的是组织细胞、生物大分子、病毒、细菌等结构,能够观察到不同病的病理结构,也可以鉴别一些肿瘤疾病,有研究报道电子显微镜技术通过超微结构观察可以区分癌、黑色素瘤和肉瘤以及腺癌和间皮瘤;可区别胸腺瘤、胸腺类癌、恶性淋巴瘤和生殖细胞瘤;可区别神经母细胞瘤、胚胎性横纹肌瘤、Ewing氏肉瘤、恶性淋巴瘤和小细胞癌;可区别纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、平滑肌肉瘤和恶性神经鞘瘤以及区别梭形细胞癌和癌肉瘤。


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