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霍乱弧菌

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是革兰氏阴性菌,菌体短小呈逗点状,有单鞭毛、菌毛,部分有荚膜。共分为139个血清群,其中O1群和O139群可引起霍乱 [1]

霍乱弧菌是人类霍乱的病原体,霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一。曾在世界上引起多次大流行,主要表现为剧烈的呕吐,腹泻,失水,死亡率甚高。属于国际检疫传染病。

弧菌属(Vibrio)中霍乱弧菌(V.cholerae)、引起一种烈性肠道传染病,发病急、传染性强、病死率高,属于国际检疫传染病。

霍乱弧菌包括两个生物型:古典生物型(Classical biotype)和埃尔托生物型(EL-Tor bio-type)。这两种型别除个别生物学性状稍有不同外,形态和免疫学性基本相同,在临床病理及流行病学特征上没有本质的差别。自1817年以来,全球共发生了七次世界性大流行,前六次病原是古典型霍乱弧菌,第七次病原是埃尔托型所致 [1]

1992年10月在印度东南部又发现了一个引起霍乱流行的新血清型菌株(0139),它引起的霍乱在临床表现及传播方式上与古典型霍乱完全相同,但不能被01群霍乱弧菌诊断血清所凝集,抗01群的抗血清对0139菌株无保护性免疫。在水中的存活时间较01群霍乱弧菌长,因而有可能成为引起世界性霍乱流行的新菌株。

新从病人分离出古典型霍乱弧菌和ELtor弧菌比较典型,为革兰氏阴性菌,菌体弯曲呈弧状或逗点状,菌体一端有单根鞭毛和菌毛,无荚膜与芽胞。经人工培养后,易失去弧形而呈杆状。取霍乱病人米泔水样粪便作活菌悬滴观察,可见细菌运动极为活泼,呈流星穿梭运动。在液体培养基内常呈单个、成对成链状,有的相连呈S形,甚至螺旋状 [1]

营养要求不高,在PH8.8~9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。因其他细菌在这一PH不易生长,故碱性蛋白胨水可作为选择性增殖霍乱弧菌的培养基。在碱性平板上菌落直径为2mm,圆形,光滑,透明。

霍乱弧菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐,靛基质反应阳性,当培养在含硝酸盐及色氨酸的培养基中,产生靛基质与亚硝酸盐,在浓硫酸存在时,生成红色,称为霍乱红反应,但其他非致病性弧菌亦有此反应,故不能凭此鉴定霍乱弧菌。EL Tor型霍乱弧菌与古典型霍乱弧菌生化反应有所不同。前者Vp阳性而后者为阴性。前者能产生强烈的溶血素,溶解羊红细胞,在血平板上生长的菌落周围出现明显的透明溶血环,古典型霍乱弧菌则不溶解羊红细胞。个别EL Tor型霍乱弧菌株亦不溶血。

根据弧菌O抗原不同,分成Ⅵ个血清群,第Ⅰ群包括霍乱弧菌的两个生物型。第Ⅰ群A、B、C三种抗原成份可将霍乱弧菌分为三个血清型:含AC者为原型(又称稻叶型),含AB者为异型(又称小川型),A、B、C均有者称中间型(彦岛型)。

霍乱弧菌古典生物型对外环境抵抗力较弱,EL-Tor生物型抵抗力较强,在河水、井水、海水中可存活1~3周,在鲜鱼,贝壳类食物上存活1~2周。

霍乱弧菌对热,干燥,日光,化学消毒剂和酸均很敏感,耐低温,耐碱。湿热55℃,15分钟,100℃,1~2分钟,水中加0.5ppm氯15分钟可被杀死。0.1%高锰酸钾浸泡蔬菜、水果可达到消毒目的。在正常胃酸中仅生存4分钟。

能发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖等产酸产气,迟缓发酵乳糖。不分解阿拉伯糖、水杨素、卫矛醇、鼠李糖、木糖、侧金盏花醇和肌醇。氧化酶、明胶液化试验阳性。V-P试验大多数EL-Tor生物型阳性,而古典生物型大多为阴性。霍乱弧菌能分解色氨酸产生吲哚,同时能还原硝酸盐为亚硝酸盐。因此当霍乱弧菌培养在含硝酸盐的蛋白胨水中,所产生的亚硝酸盐与吲哚结合成亚硝基吲哚,滴加浓硫酸即出现蔷薇色,称为霍乱红试验阳性 [1]

根据弧菌O抗原不同,分成Ⅵ个血清群,第Ⅰ群包括霍乱弧菌的两个生物型。第Ⅰ群A、B、C三种抗原成份可将霍乱弧菌分为三个血清型:含AC者为原型(又称稻叶型),含AB者为异型(又称小川型),A、B、C均有者称中间型(彦岛型)。

1992年10月在印度东南部又发现了一个引起霍乱流行的新血清型菌株(0139),它引起的霍乱在临床表现及传播方式上与古典型霍乱完全相同,但不能被01群霍乱弧菌诊断血清所凝集,抗01群的抗血清对0139菌株无保护性免疫。在水中的存活时间较01群霍乱弧菌长,因而有可能成为引起世界性霍乱流行的新菌株,推荐使用天津生物芯片生产的霍乱弧菌诊断血清。

1,普通聚合酶链反应法

核酸扩增技术,即聚合酶链式反应(polymerase chainreaction,PCR),其基本原理是设计、合成两条寡核苷酸,作为引物,对应于待测病原微生物某一段特异性序列的两端,然后在体外模拟DNA体内复制的过程反复扩增,使靶序列放大上万倍甚至上百万倍而被检测出来。一般选择霍乱肠毒素(cholera enterotoxin,CT)基因ctx的保守序列作为靶基因。一些非产毒株(如环境来源的菌株)有可能通过基因水平转移获得毒力基因成为产毒株,若仅检测ctx基因容易造成漏检。因此,霍乱弧菌的其他重要基因,如毒力协同调节菌毛A基因(tcp A)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表达调控基因(toxR)等也被选用为PcR的靶基因,这大大提高了检测的特异度.

2 ,多重PCR法

与常规PCR相比,多重PCR一次反应可检测多个基因,节省了时间和成本。国内、外许多学者选用霍乱弧菌的毒素基因ctx、tcp与其他基因如ompW、rfb、hly进行组合,作为共同的靶基因,克服了由于毒力基因特异度不够高而造成的假阳性。多重PcR同时可准确区分不同血清型的霍乱弧菌和快速鉴定其是否为产毒株,可谓一举多得,大大提高了检测效率。

3.荧光定量PCR法

荧光定量PCR自动化程度高、特异性强、无交叉污染,在霍乱弧菌的快速诊断中得到广泛应用。尤其是近年来,随着引物与探针的设计更精确、多通道荧光PCR仪的开发与广泛使用,多重荧光定量PCR技术日臻成熟,并以其高通量、低成本、高效率等优点而广泛应用于病毒、细菌、真菌等多种病原体的快速检测,成为应用的热点.

与PCR方法相比,基因芯片技术能同时获得更多病原学、生物学方面的信息,从而更为全面地分析、掌握病原微生物的特征。Vora等[12]运用基因芯片技术对多种致病性弧菌的毒力、毒素、耐药基因及潜在的毒力基因进行全面分析,对掌握这些细菌的致病性及进行有效预防、控制等具有重要意义。但基因芯片成本较高,距离推广应用尚需时间等待 [2]

人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者,主要通过污染的水源或饮食物经口传染。在一定条件下,霍乱弧菌进入小肠后,依靠鞭毛的运动,穿过粘膜表面的粘液层,可能藉菌毛作用粘附于肠壁上皮细胞上,在肠粘膜表面迅速繁殖,经过短暂的潜伏期后便急骤发病。该菌不侵入肠上皮细胞和肠腺,也不侵入血流,仅在局部繁殖和产生霍乱肠毒素,此毒素作用于粘膜上皮细胞与肠腺使肠液过度分泌,从而患者出现上吐下泻,泻出物呈“米泔水样”并含大量弧菌,此为本病典型的特征。

霍乱肠毒素本质是蛋白质,不耐热,56℃经30分钟,即可破坏其活性。对蛋白酶敏感而对胰蛋白酶抵抗。该毒素属外毒素,具有很强的抗原性。现已能将该毒素高度精制成晶状,仍保持极强的生物学活性。霍乱肠毒素致病机理如下:毒素由A和B两个亚单位组成,A亚单位又分为A1和A2两个肽链,两者依靠二硫链连接。A亚单位为毒性单位,其中A1肽链具有酶活性,A2肽链与B亚单位结合参与受体介导的内吞作用中的转位作用。B亚单位为结合单位,能特异地识别肠上皮细胞上的受体。1个毒素分子由一个A亚单位和4℃6个B亚单位组成多聚体。霍乱肠毒素作用于肠细胞膜表面上的受体(由神经节苷脂GM1组成),其B亚单位与受体结合,使毒素分子变构,A精致单位进入细胞,A1肽链活化,进而激活腺苷环化酶(AC),使三磷酸腺苷(ATP)转化为环磷酸腺苷(cAMP),细胞内 cAMP浓度增高,导致肠粘膜细胞分泌功能大为亢进,使大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈吐泻,由于大量脱水和失盐,可发生代谢性酸中毒,血循环衰竭,甚至休克或死亡。

霍乱弧菌产生肠毒素,是一种剧烈的致泄毒素。该毒素作用于肠壁促使肠黏膜细胞极度分泌从而使水和盐过量排出,导致严重脱水虚脱;进而引起代谢性酸中毒和急性肾功能衰竭 [1]

引起烈性肠道传染病霍乱,为我国的甲类法定传染病。在自然情况下,人类是霍乱弧菌的唯一易感者。在地方性流行区,除病人外,无症状感染者也是重要传染源。高比例的无症状携带者有利于疾病的扩散,根据卫生状况,无症状携带者和病人的比率波动在10:1~100:1之间。

传播途径主要是通过污染的水源或未煮熟的食物如海产品、蔬菜经口摄入。居住拥挤,卫生状况差,特别是公用水源是造成暴发流行的重要因素。人与人之间的直接传播不常见。在正常胃酸条件下,如以水为载体,需饮入大于1010个细菌方能引起感染;如以食物作为载体,由于食物高强度的缓冲能力,感染剂量可减少到102~104个细菌。任何能降低胃中酸度的药物或其他原因,都可使人对霍乱弧菌感染的敏感性增加。

病菌到达小肠后,粘附于肠粘膜表面并迅速繁殖,不侵入肠上皮细胞和肠腺,细菌在繁殖过程中产生肠毒素而致病。O1群霍乱弧菌感染可从无症状或轻型腹泻到严重的致死性腹泻。在古典生物型霍乱弧菌感染中,无症状者可达60%,在El Tor生物型感染中,无症状者可达75%。霍乱弧菌古典生物型所致疾病较El Tor生物型严重。典型病例一般在吞食细菌后2~3天突然出现剧烈腹泻和呕吐,多无腹痛,每天大便数次或数十次。在疾病最严重时,每小时失水量可高达1升,排出由粘膜、上皮细胞和大量弧菌构成的如米泔水样的腹泻物。由于大量水分和电解质丧失而导致失水,代谢性酸中毒,低碱血症和低容量性休克及心力不齐和肾衰竭,如未经治疗处理,病人可在12~24小时内死亡,死亡率高达25%~60%,但若及时给病人补充液体及电解质,死亡率可小于1%。O139群霍乱弧菌感染比O1群严重,表现为严重脱水和高死亡率,且成人病例所占比例较高,大于70%,而O1群霍乱弧菌流行高峰期,儿童病例约占60%。

病愈后一些患者可短期带菌,一般不超过3~4周,真正的慢性带菌者罕见。病菌主要存在于胆囊中。

患过霍乱的人可获得牢固的免疫力,再感染者少见。病人在发病数日,血液中即可出现特异性抗体,7℃14天抗体滴度达高峰,随后逐渐下降至较低水平,但能持续约3个月之外。病后小肠内可出现分泌型lgA。体液抗体与免疫的关系尚不清楚,一般认为局部SlgA可在肠粘膜与病菌之间形成免疫屏障,有阻断粘附和中和毒素的作用。

由于霍乱流行迅速,且在流行期间发病率及死亡率均高,危害极大,因此早期迅速和正确的诊断,对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。

采取病人“米泔水样”大便或呕吐物。镜检(涂片染色及悬滴法检查)观察细菌形态,动力特征。

可将材料接种至碱性蛋白胨水37℃培养6~8小时后,取生长物作形态观察,并转种于碱性平板作分离培养,取可疑菌落作玻片凝集,阳性者再作生化反应及生物型别鉴定试验。

取检材或新鲜碱性蛋白胨水培养物一滴,置于载玻片上,再加霍乱弧菌多价诊断血清,加盖玻片,用暗视野镜观察,3分钟内运动被抑制的即为阳性,此法优点是快速而特异操作简便,但必须有数量较多的弧菌才检出。

除一般免疫荧光法外,还可用荧光菌球法检查。

霍乱弧菌所致的霍乱,为烈性肠道传染病,曾在世界上发生过几次大流行,至今仍未平息,因此,霍乱被列为国境检疫的传染病。

霍乱弧菌有两个生物型,一为古典生物型,一为爱尔托生物型,这两个生物型在形态及血清学性状方面几乎相同,可作第四组霍乱噬菌体裂解试验,多粘菌素B敏感试验,鸡红细胞凝集试验,V-P(服-泼)二氏试验等试验加以鉴别:

本菌是需氧菌,营养要求不高,在普通培养基上生长良好。霍乱弧菌具有耐碱性,故常用碱性(pH值8.4~9.2)培养基选择性分离培养本菌。在碱性琼脂平板上生长后,呈水滴样光滑型菌落,而在碱性蛋白胨液体培养基中,生长迅速,培养6~8小时即可形成菌膜,利用这一特点,可以作快速增菌,进行鉴定。在庆大霉素琼脂平板上,生长快,8~10小时能生长出小菌落,可供鉴定用。霍乱弧菌能分解蔗糖、甘露醇,产酸不产气,不能分解阿拉伯胶糖。

霍乱弧菌在未经处理的粪便中,可存活数天;在冰箱内的牛奶、鲜肉和鱼虾水产品中存活时间分别为2~4周、1周和1~3周;在室温下存放的新鲜蔬菜中,可存活1~5天;在砧板和布上可存活相当长时间;在玻璃、瓷器、塑料和金属上存活时间不超过2天。霍乱弧菌古典生物型在外界环境中生存能力不强,而爱尔托生物型抵抗力较强,在河水、井水、池塘水和海水中可存活1~3周,甚至更长,有时在局部自然水中也能越冬。爱尔托生物型弧菌可粘附于海洋甲壳类生物表面,分泌甲壳酶,分解甲壳作为营养而长期存活,如爱尔托生物型弧菌被人工饲养的泥鳅、鳝鱼吞食后,可在其体内生长繁殖,然后排入水中。

霍乱弧菌对热、干燥、日光及一般消毒剂均很敏感,经干燥2小时或加热55℃10分钟即可死亡,煮沸立即死亡;对酸敏感,在正常胃酸中仅能存活4分钟,接触1∶5000~1∶10000盐酸或硫酸、1∶2000~1∶3000升汞或1∶500000高锰酸钾,数分钟即被杀灭,在0.1%漂白粉中10分钟内即可死亡。氯化钠的浓度高于4%或蔗糖浓度在5%以上的食物、香料、醋及酒等,均不利于霍乱弧菌的生存。

正常胃酸可杀灭霍乱弧菌,当胃酸分泌缺乏或低下,或入侵的霍乱弧菌数量较多,未被杀灭的弧菌就进入小肠,在碱性肠液内迅速繁殖,并通过粘液对细菌的趋化吸引作用、细菌鞭毛活动及弧菌粘蛋白溶解酶和粘附素等的作用,粘附于小肠粘膜的上皮细胞表面,并在此大量繁殖。

此菌产生强烈的外毒素,即霍乱肠毒素,由A亚单位和B亚单位组成。B亚单位与该处粘膜上皮细胞表面受体神经节苷脂结合,A、B两种亚单位解离,A亚单位穿过细胞膜进入细胞内,激活腺苷酸环化酶(AC),使细胞内三磷酸腺苷(ATP)转化为环磷酸腺苷(cAMP),使细胞内环磷酸腺苷含量提高,促使一系列酶反应加速进行,导致空肠到回肠部腺细胞分泌功能亢进,引起大量液体及血浆中的钠、钾、氯等离子进入肠腔,由于分泌功能超过肠道再吸收能力,从而造成严重的腹泻及呕吐;由于胆汁分泌减少,且肠腔中有大量水、粘液及电解质,故排泻物呈白色“米泔水”样;由于剧烈吐泻,导致脱水和电解质丢失,引起缺钾、缺钠及肌肉痉挛;由于碳酸氢根离子丢失,酸性代谢物在体内蓄积,引起代谢性酸中毒;由于有效血容量急剧减少,血液浓缩,导致尿量减少、血压下降,甚至休克;由于肾缺血、缺氧,细胞内缺钾,导致肾小管上皮细胞变性、坏死,造成急性肾功能衰竭。

主要病变均由严重脱水引起,临床可见指纹皱缩,皮下组织及肌肉干瘪。心、肝、脾等脏器均见缩小。内脏浆膜无光泽。肠腔高度扩张、肠内充满泔水样液体,肠粘膜松弛,但粘膜上皮完整,无溃疡。胆囊内充满粘稠胆汁。肾小球及间质的毛细管扩张,肾小管肿胀、变性及坏死。其他脏器也有出血、变性等变化。

必须贯彻预防为主的方针,作好对外交往及入口的检疫工作,严防本菌传入,此外应加强水、粪管理,注意饮食卫生。对病人要严格隔离,必要时实行疫区封锁,以免疾病扩散蔓延。

人群的菌苗预防接种,可获良好效果,现用加热或化学药品杀死的古典型霍乱菌苗皮下接种,能降低发病率。这种苗菌对EL-Tor型霍乱弧菌感染也有保护作用,但持续时间短,仅3-6个月。目前有新型的口服rBS/WC疫苗(重组B亚单位/霍乱菌体疫苗)可用于预防霍乱,2000年WHO关于霍乱疫苗的意见书提出,“应考虑对有罹患霍乱危险性的人群使用rBS/WC疫苗”。该疫苗对霍乱的保护期为3年,国内有上海联合赛尔生物工程有限公司生产rBS/WC疫苗。 

治疗主要为及时补充液体和电解质及应用抗菌药物如链霉素、氯霉素、强力霉素、复方SMZ-TMP等。


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