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披膜病毒

在病毒核壳外面披盖着一层保护其活性的蛋白包膜的一类病毒。病毒粒呈球形,直径多为40~70纳米,核心为直径25~35纳米的二十面体核壳,内含连续线型正链RNA。核壳包裹在紧贴的脂质包膜内,包膜上有糖蛋白的突起。大多数能在节肢动物、脊椎动物体内以及它们的组织培养细胞内增殖。其中甲病毒类可引起人、马脑炎;黄病毒类可引起人黄热病、登革热病、绵羊跳跃病;风疹病毒可引起风疹。还有猪瘟病毒、牛腹泻粘膜病病毒和羊边界病病毒等。

本科病毒的组成相当庞大, 成员复杂, 其中许多成员过去被称为“虫媒病毒”(Arbovirus ),因为当时披膜病毒科只包括甲病毒属和黄病毒属,几乎所有成员均由节肢昆虫传播,故有此名。但必须指出,“虫媒病毒”不是一个分类学名称,它只是反映当时研究状况的一个通俗但又含糊的名称,只能说明这类病毒由昆虫传播这一流行病学特征。广义上说,具有虫媒性质的病毒还包括另一些科或属的病毒,如布尼安病毒科、环状病毒属和弹状病毒科的某些成员以及非洲猪瘟病毒、某些呼肠孤病毒和痘病毒。 随着病毒学的不断发展, 披膜病毒科增加了许多新成员,它们多半并不具有虫媒传播特性。所以,“虫媒病毒”这一名称现已不再使用,而命名为“披膜病毒科”(Togaviridae)。

有关病毒的分类,世界各国均以国际病毒分类委员会(ICTV)报告“病毒分类与命名”中的描述为准。最初的披膜病毒科只包括甲病毒属(Alphavirus)和黄病毒属(Flavivirus),在76年增加了风疹病毒属(Rubivirus)和瘟病毒属(Pestivirus),使该科病毒总计达4个属。进一步研究发现黄病毒属成员的基因组结构和基因转录过程,与甲病毒很不相同,于是1986年,在ICTV第三次报告中,将黄病毒属从披膜病毒科抽出来,成立了一个独立的病毒科黄病毒科,而将动脉炎病毒属(Arterivirus)纳入,使其成为披膜病毒科的新成员。此后,瘟病毒的基因克隆研究发现, 该属病毒的基因组结构及其表达方式与黄病毒十分相似,因此在1991年ICTV公布的第四次报告中,将瘟病毒属纳入黄病毒科,从而使披膜病毒科的成员减为3个属。随着分子病毒学的发展,病毒的基因组结构及其功能被不断认识,所以各病毒的分类地位也在不断调整之中,以便更加合理。最新研究表明,动脉炎病毒属的基因组结构和复制方式与冠状病毒相似,而与披膜病毒科成员相去甚远,所以,在1995年ICTV的第五次报告中又将动脉炎病毒属从披膜病毒科提出来,放入冠状病毒科。但是这一分类地位可能只是暂时性的,因为,除基因组结构与复制方式外,动脉炎病毒与冠状病毒有很大差别:其基因组大小和病毒粒子大小仅为冠状病毒的一半;表面纤突相对较小而且不清楚,纤突蛋白的结构也不相同。所以有人建议成立动脉炎病毒科。本书鉴于动脉炎病毒属的分类地位尚未最后确定,同时考虑到其传统分类地位,所以仍将动脉炎病毒属纳入披膜病毒科进行讨论。

顾名思义,披膜病毒是一类具有囊膜的病毒,病毒粒子呈球状,直径在60~70nm之间,分子量约52×10.6kDa。在蔗糖密度梯度中的浮密度为:甲病毒,1.22g/cm?3; 风疹病毒,1.18~1.19g/cm?3;动脉炎病毒,1.13~1.17g/cm?3 。 甲病毒和风疹病毒的沉降系数约为280 S,动脉炎病毒的沉降系数约为200~230 S。核衣壳呈二十面立体对称,直径30~40nm,含单股线状RNA基因组。病毒核酸分子量约4×10 .6kDa, 占病毒粒子总重量的8%~9%。 披膜病毒的蛋白质种类很少,病毒粒子只含3~4种蛋白质, 占病毒粒子重量的62%。病毒囊膜为双层类脂膜,来源于细胞的胞浆膜,囊膜紧密包裹着核衣壳,表面有糖蛋白组成的纤突(长4~10nm)。病毒粒子一般只含有2种糖蛋白,E1和E2,分子量分别为45~53kDa和53~59kDa。某些甲病毒,如西门利克林病毒(Semliki forest virus,SFV),含有第三种糖蛋白E3,其分子量约10kDa。在病毒粒子上,糖蛋白E1和E2形成异二聚体,它们具有红细胞吸附活性,含有中和性抗原表位,在甲病毒还含有血清型与亚型的特异抗原表位。这种异二聚体构成了病毒囊膜表面的纤突,在病毒粒子表面,每三个纤突组成1个三聚体(trimer),纤突排列成T=4二十面体晶格,恰好与衣壳蛋白组成的T=4二十面体立体对称结构呈1对1的相应关系。因此,整个病毒粒子有240个纤突(形成80个三聚体)和240个衣壳蛋白单位。这样的形态结构至少已在甲病毒属成员,如辛德毕斯病毒,获得证实。

病毒核衣壳蛋白,也称为核心蛋白(C),分子量为30~33kDa。序列分析表明, 辛德毕斯病毒C蛋白有一个类似于某些植物病毒核衣壳蛋白的结构:N端大约115个残基带正电荷,可能与病毒基因组RNA特异性地相互作用,以起始核衣壳的形成过程;其余部分约150个残基,与糖蛋白E2膜内的C端相连,这一区域在所有甲病毒都是保守的。

病毒的脂质来源于宿主细胞的胞浆膜,约占病毒粒子干重的30%。 脂类的组成取决于病毒感染的细胞类型。磷脂与胆固醇的比例在甲病毒为2∶1,风疹病毒为4∶1。糖约占病毒粒子重量的6%,存在于糖蛋白中,主要有甘露糖和N聚糖(N linked glycan),此外,风疹病毒E2含有O聚糖(O linked glycan)。

甲病毒稳定存在于pH值7~8的环境,而在酸性条件下,则很快被灭活。大多数甲病毒对热敏感,37℃时的半存活期为7小时, 但58℃时很快灭活。风疹病毒在37℃时的半存活期只有1~2小时,58℃时的半存活期为5~20分钟。由于有脂质囊膜, 所有披膜病毒对有机溶剂(乙醚和氯仿等)和去污剂敏感。

披膜病毒基因组为单股正链RNA,沉降系数42~49S,5'端一般有帽结构,3'端有Poly(A)尾。基因组RNA具有感染性。在感染起始阶段,病毒基因组可直接作为 mRNA,翻译病毒复制所需的一些酶(非结构蛋白) 。核酸序列测定表明,甲病毒基因组大小为11~12kb;风疹病毒基因组大小约9?7kb(不包括3端Poly (A)尾);动脉炎病毒基因组12.5~15.1kb。披膜病毒基因组5端帽结构与真核mRNA相似,但也有其自身特点,如在甲病毒粒子中,基因组RNA 5端有O型帽结构(含m7G), 而在感染细胞中,甲病毒RNA除m7G帽结构外,少量病毒RNA还含有m2,7G和m2,2,7G的帽核苷酸。甲病毒RNA 3'端Poly (A)尾比真核mRNA和其它病毒RNA平均短70个nt。无Poly (A)尾的病毒RNA则没有感染性。

甲病毒和风疹病毒基因组分为二个编码区段,各含有一个长的开放阅读框架。5'端2/3基因组编码病毒的4种非结构蛋白,主要是病毒复制酶和转录酶。3'端1/3基因组编码病毒的结构蛋白,即核心蛋白和糖蛋白。二个区段之间为非编码的连接区。甲病毒连接区长40~50nt,含有结构蛋白mRNA的转录起始信号。其基因组5'端还有60~80nt长的非编码区,3'端有121~524nt长的非编码区。

病毒基因组有三个比较保守的区域:①5'端非编码区有51nt长的保守序列,可形成发卡结构;② 3'端靠近Poly (A)尾有19nt长的保守序列,对从基因组转录有重要作用;③连接区内有21nt长的保守序列,可能是启动子,启动结构蛋白mRNA的转录。5'末端可形成一个比较保守的茎-环结构。

甲病毒感染细胞后,49S的基因组RNA即作为mRNA,首先翻译出一个多聚蛋白前体,这一多聚蛋白被逐级酶解成4种非结构蛋白, 即 nsP1,nsP2,nsP3和nsP4, 它们在基因组上的顺序为NnsP1nsP2nsP3nsP4C。nsP1 可能参与病毒RNA帽结构的形成以及起始负链RNA合成,nsP2既是非结构蛋白前体的蛋白酶,可能也是病毒RNA复制所需的螺旋酶,nsP3也是RNA复制所需要的,nsP4被认为是病毒RNA聚合酶。 这4种蛋白质构成了病毒复制酶/转录酶系统, 这对合成病毒基因组的负链拷贝和从负链转录病毒结构蛋白mRNA是非常必要的。

风疹病毒非结构蛋白加工的细节尚不清楚,但该病毒的非结构蛋白前体同样有一些与甲病毒类似的具有螺旋酶、复制酶和蛋白酶功能的核心肽段,然而这些核心肽段在风疹病毒基因组上的排列顺序不同于它们在甲病毒基因组上的排列顺序。

病毒结构蛋白是由基因组负链转录的mRNA翻译的,所以也叫晚期蛋白。甲病毒结构蛋白mRNA长约4 100nt,是亚基因组RNA,具有5'端帽结构和3'端Poly (A)尾,沉降系数26S,所以通常称为26S RNA。其长度变化反映出各病毒成员基因组3?端非编码区长度的不同。在感染细胞中,26S RNA 浓度很高,翻译效率也很高。与49S RNA一样,26S RNA先翻译出一个多聚蛋白前体,一前体在刚合成时就立即被酶解,首先产生核心C蛋白。 研究表明这一酶解是由C蛋白自身催化的,因为它含有丝氨酸蛋白酶的活性位点。C蛋白产生后,余下的蛋白前体在蛋白酶作用下裂解成3种糖蛋白(E1、E2和E3)和另一种6K的蛋白质。 这些蛋白质在基因组上的顺序为N?C?E3?E2?6K?E1?C。C 蛋白形成后很快(5~7分钟)就与病毒基因组RNA相结合,包装成核衣壳。C蛋白的N 端一半与基因组RNA相结合。 C端一半参与核衣壳的形成,在病毒释放过程中与糖蛋白间相互作用,此外还有自身蛋白酶活性。某些甲病毒如SFV有E3,其E2较小。大部分甲病毒的E2较大,因为E3成为E2的一部分,并没有被加工切割。E2和E1形成功能性异二聚体,构成了病毒囊膜的纤突,E2的膜内区与核衣壳相结合,其膜外区带有甲病毒主要中和性抗原位点。E1也有一个中和性抗原位点,其保守区有细胞融合特性,可吸附红细胞,但E1和E2的抗体都能阻断血凝反应。6K蛋白位于E2和E1之间,是一个内部的信号序列,可使E1进入内质网。E1与E2在进入时就被糖基化,然后通过高尔基体搬运到胞浆膜。动脉炎病毒的结构蛋白是由6种亚基因组mRNA翻译的。

目前对披膜病毒复制的认识都基于对二种关系很近的甲病毒辛德毕斯病毒(SINV)和SFV在哺乳动物细胞中增殖的研究结果。

披膜病毒的复制周期起始于病毒与易感细胞的结合,终止于新病毒从细胞膜释放出来,该病毒的复制在胞浆中进行。在细胞中,病毒特异的生物学活动主要分三个阶段: ①病毒基因组的复制;②病毒结构蛋白的合成与成熟;③病毒粒子装配。

披膜病毒与细胞的结合是受体介导的,但目前尚未分离鉴定出这一特异受体。病毒与细胞的结合依赖于环境的pH值和离子强度( 较低的pH值和离子强度能促进病毒与细胞结合),或许更依赖于病毒与细胞间相对的电荷状态。 病毒靠其囊膜表面的纤突与细胞结合,随后通过细胞胞饮进入胞浆,在胞浆中被包裹形成酸性吞噬小体(endosome)。在低pH环境中,病毒囊膜与吞噬小体膜融合,从而导致病毒糖蛋白的构象改变,核衣壳随后进入胞浆,并脱壳和释放出基因组RNA。这就是甲病毒进入细胞的“吸附胞饮”(adsorptive endocytosis)机制。此外可能还存在其它进入细胞的机制,特别是在节肢昆虫细胞中,形成这种酸性吞噬小体似乎并非甲病毒感染所必需。

病毒进入细胞约1小时后,脱衣壳的病毒RNA即作为mRNA合成4种非结构蛋白, 以起始病毒的复制。在复制过程中,基因组5和3端非编码区以及26S RNA启动子上游均存在一些顺式调控元件,用于调控负链和正链RNA的合成。在感染细胞中, 存在49S和26S二种正链RNA。49S RNA既是基因组RNA,又是非结构蛋白的mRNA,26S RNA是结构蛋白mRNA, 它们均由全长负链拷贝转录而来。全长负链 RNA 的合成是病毒基因组RNA复制的开始, 感染后1小时即可发生。感染后约3小时,49S和26S RNA开始合成。新合成的49S RNA有3种归宿:①作为mRNA 与细胞中的核糖体结合,从而合成病毒的非结构蛋白;② 作为模板,继续复制全长负链拷贝;③与核心蛋白结合,包装成核衣壳。在病毒RNA合成的整个过程中, 负链只占整个RNA合成量的10%,感染后5~6小时,负链合成即关闭,而正链的合成可在稳定的速率下继续数小时。在感染早期,26S RNA量相对较多,到了后期49S RNA则相对占优势。但在整个感染周期中,26S RNA占绝对优势,其与49S RNA的克分子比为3∶1。49S RNA还要包装成核衣壳,这样在翻译过程中,26S RNA与核糖体形成的复合物是49S RNA的10倍。所以在感染细胞中容易检测到病毒结构蛋白,而非结构蛋白因合成量太少,加之它合成于感染早期(在细胞蛋白合成终止之前),故很难检出和分离。感染后2小时,在感染细胞中即能检测到病毒结构蛋白。其中C蛋白产生后,很快与病毒RNA结合,组装成核衣壳。 结构性糖蛋白通过信号序列插入到内质网, 随后转运到高尔基体和胞浆膜,在转运过程中被糖基化和酯酰化, 成为一种穿膜蛋白,最后与核衣壳包装成病毒粒子,由细胞表面出芽释放。

病毒感染可造成脊椎动物宿主细胞的蛋白质合成终止,从而导致细胞死亡( 溶细胞性感染)。但病毒感染并不造成蚊细胞蛋白质合成的终止, 因而蚊细胞免于死亡(非溶细胞性感染),病毒则形成持续性感染而长期生存。病毒在蚊细胞中的装配似乎与在脊椎动物细胞中的不同。

根据宿主细胞和传代条件的不同, 披膜病毒在高浓度传代过程中可出现缺失干扰颗粒(DI颗粒),在DI颗粒中病毒RNA也是缺失的,大约只有正常RNA 一半,甚至1/5,这叫缺失RNA。缺失RNA常保留病毒复制与包装的识别序列。


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