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瑞氏染液

瑞氏染液由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料,溶于甲醇 ,后解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。

瑞氏(Wright's staim;美蓝-伊红Y)染色:

1.瑞氏染料是由碱性染料美蓝(Methvlem blue)和酸性染料黄色伊红(Eostm Y)合称伊红美蓝染料即瑞氏(美蓝-伊红Y)染料。

2.用甲醇作瑞氏染料溶剂,即成瑞氏染液。甲醇是瑞氏染料良好溶剂,有两种作用:

(1)甲醇使瑞氏染料中美蓝(M)与伊红(E)在溶液中离解,可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色。

甲 醇

ME(瑞氏染料)----→M+ + E-

在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青,美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色,但不能使胞浆染为蓝色,多余美蓝就可以使胞浆染成蓝色,染色主要是化学作用,是离子彼此结合的反应。

(2)甲醇具有强大的脱水力,可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积,提高细胞对染料吸收作用,同时由于甲醇吸附染色液中的水,使染色液升温,加速染色反应。

(1) 瑞氏染液配制:

瑞氏染料 830gm或1g

甲醇(AR) 500ml或600ml

○先称干燥(事先放入温箱干燥过夜)瑞氏染料放置乳钵内,用乳棒轻轻敲碎染料成粉末,再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末,加少许甘油或甲醇溶解研磨,使染料在乳缸内显“一面镜”光泽,而无染料粉粒沉着。

○再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮,静置片刻,将上层液体倒入一清洁储存瓶内(最好用甲醇空瓶),再加甲醇研磨,重复数次,至乳钵内染料及甲醇用完为止,摇匀,密封瓶口。

○存室温暗处,储存愈久,则染料溶解、分解就越好,一般储存3个月以上为佳。

(2) 缓冲液:

●缓冲液作用:

○染色对氢离子浓度是十分敏感的,据观察pH值的改变,可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。

○缓冲液须保持一定的pH使染色稳定,PBS的pH 一般在6.4~6.8,

○偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用,偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用,使pH恒定。

(pH6.4~6.8,弱酸性):

配方1 :  配方2:

1% KH2PO4 30ml  M/15 KH2PO4 73.5 ml

1% Na2HPO4 20ml   M/15 Na2HPO4 26.5ml

H2O(新鲜)  加至1000ml

置室温黑暗处,瓶口密封,防止霉菌污染,如有污染则应报废。

姬姆萨(Giemsa's stain;天青-伊红)染色

1.姬姆萨染料是伊红(AzurII Eqsin)和天青(蓝)2号合成的。

2.姬姆萨染料( Giemsa, 天青-伊红)染液配制:

姬姆萨染料(粉末)  0.5g或7.5g

甲醇(AR)  33ml 或500ml

甘油(AR)  33ml或 500ml

●先将姬姆萨染料放入乳钵中,逐渐倒甘油研磨溶于甘油中,置于56℃水温箱内,90~120分钟,然后加入甲醇,摇匀后放置数天,过滤后或不过滤即可使用。此染液放置室温阴暗处,时间越长越好。

●使用染液可临时配置):姬姆萨染液1ml,加DDH2O10ml混匀。即可使用。

(1)先用甲醇固定2~3分钟。

(2)将血或骨髓涂片放置姬姆萨使用液15~30分钟。

(3)涂片用自来水冲洗,在室温中干燥待查。

瑞氏或姬姆萨染色液鉴定:刚配好或放置一个月以上的染液可进行下列鉴定:

1.取1滴染液于乳白玻板上,自行迅速扩散开,其颜色变紫红色,且有伪足形成。

2.取1滴染液加1滴缓冲液,染液由深蓝色立即变为紫红色。

3.取血片或骨髓片进行试染检查,观察染色后各类细胞的胞核、胞浆及颗粒着色情况,pH是否合适及染色合适时间。如有上述变化,表明染液合格,可供使用。

瑞氏染色(Wright's)-姬姆萨(Giemsa's)混合染色:

●瑞氏染色的染料配方浓度对细胞核着色程度适中,细胞核结构和色泽清晰艳丽,对核结构的识别较佳,但对胞浆着色偏酸,色泽偏红,对细胞浆内颗粒特别是嗜天青颗粒及嗜中性颗粒着色较差。

●姬姆萨染色对胞浆着色能较好的显示胞浆的嗜碱性程度,特别对嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗粒着色较清晰, 色泽纯正,而对胞核着色偏深,核结构显示较差。

●故采用以瑞氏染液为主,姬姆萨染液为辅的混合染色。

染色步骤:

1. 先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖;

2. 稍等片刻再加姬姆萨染液2-3滴加减(根据涂片上细胞多少及增升程度酌情而定);

3. 稍等1-2分钟后,再加磷酸盐缓冲液,加时应缓慢地一滴一滴加在涂片膜上,直至膜面上染色液形成表面张力而终止染色液加入;

4. 染色30-40分钟;

5. 分色:用自来水缓缓冲洗至少3分钟以上,待干,勿用滤纸吸干,以免滤纸纤维污染涂片。


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